本发明专利技术涉及一株具有弱H+-ATPase活性的保加利亚乳杆菌及其筛选方法和应用，所述的保加利亚乳杆菌分类命名为Lactobacillus?delbrueckii?subsp.bulgaricus?ND06-2，保藏登记号为CGMCC?No.7134，可以作为弱后酸化发酵剂使用。本发明专利技术利用含有硫酸新霉的MRS平板筛选，得到一株具有弱H+-ATPase活性的菌株，该菌株在脱脂乳中乳酸、乳糖和半乳糖的代谢能力明显低于出发菌株，可以作为弱后酸化的酸奶发酵剂在工业生产中使用。
【技术实现步骤摘要】
一株具有延缓后酸化作用保加利亚乳杆菌菌株及其应用
本专利技术涉及一株利用硫酸新霉素诱变、筛选得到的具有延缓后酸化作用的保加利亚乳杆菌菌株，以及该菌株的筛选方法及其在发酵工业中的应用，属于生物发酵
技术介绍
乳酸菌在发酵乳糖过程中能产生多种代谢产物，这些乳酸菌及其生产的代谢产物不仅具有平衡肠道菌群、降低胆固醇、抗肿瘤、免疫以及延缓衰老等生理功能，还赋予产品良好的口感和风味。我国使用的酸奶发酵剂主要有嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌。一般认为，保加利亚乳杆菌在低PH环境下能继续发酵乳糖，是引起酸奶后酸化现象的主要菌株。目前，控制酸奶后酸化的方法主要有:调整酸奶发酵剂保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的比例；在发酵乳中添加nisin等细菌素控制保加利亚乳杆菌的生长和代谢能力；改变细胞膜的通透性，抑制保加利亚乳杆菌的代谢等。其中，降低保加利亚乳杆菌的生长和能量代谢是控制后酸化现象的有效方法。H+-ATPase酶是控制乳酸菌能量代谢的一个关键酶。H+-ATPase位于乳酸菌细胞膜上，既能催化ATP的合成与水解也能调节跨膜的质子梯度，其活性随pH的降低而增强，其数量也随着pH值的下降而增多。当外界环境中pH降低时，H+-ATPase能通过水解ATP释放出自由能，推动细胞内的质子泵出胞外，形成膜PH梯度差，从而使细胞内pH维持在中性附近，使细胞内酶的活力不受影响。很多乳酸菌含有H+-ATPase,如短乳杆菌、乳酸乳球菌、乳酸链球菌和嗜热链球菌等。 硫酸新霉素(neomycin)是一种能抑制细菌生长的抗生素,利用硫酸新霉素能筛选出具有低H+-ATPase活力的菌株。其原理在于硫酸新霉素进入细胞是一个耗能的过程，需要H+-ATPase的协助，因此只有低H+-ATPase活力的菌株才能在含有硫酸新霉素的筛选培养基上生长。目前，已有一些关于利用硫酸新霉素筛选具有低H+-ATPase活力菌株的报道，包括乳酸乳球菌、瑞士乳杆菌、酒类酒球菌等，这些诱变菌株对低PH环境敏感，具有改变的细胞膜通透性以及降低生长和能量代谢能力。本专利技术针对“酸奶后酸化”这一乳品加工业的关键技术问题，以从我国青海的传统发酵乳制品中分离筛选出来的德氏乳杆菌保加利亚亚种ND06为出发菌株，利用硫酸新霉素诱变、筛选出一株具有弱H+-ATPase活性的菌株，并进一步研究了其在脱脂乳培养基中的产酸能力，可从根本上解决产品后酸化问题。
技术实现思路
为了解决保加利亚乳杆菌在酸奶储存期间引起的后酸化现象，本专利技术使用硫酸新霉素诱变、筛选出一株H+-ATPase缺陷型保加利亚乳杆菌，该菌株在脱脂乳培养基中具有弱的产酸能力，作为弱后酸化酸奶发酵剂使用。本专利技术所述的具有弱H+-ATPase活性的保加利亚乳杆菌菌株是利用硫酸新霉素诱变德氏乳杆菌保加利亚亚种ND06 (L.delbrueckii subsp.bulgaricus ND06)后筛选获得的，其中原始的德氏乳杆菌保加利亚亚种ND06 (Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus ND06)该菌株已于2013年I月15日保存在北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCCN0.7133，筛选获得的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种的分类命名为 Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus ND06-2,德氏乳杆菌保加利亚亚种 NDO6-2 (Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus ND06-2)已于 2Ol3 年 I 月15日保存于北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCCN0.7134。本专利技术还涉及所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株在制备发酵乳、发酵食品中的应用，所述菌株在42°C培养72h后，发酵乳pH值从6.44降至4，发酵乳PH值的下降幅度明显低于出发菌株pH值的下降幅度，具有弱后酸化作用。所述菌株在42°C发酵后，在室温25°C储藏21d期间，pH值的变化范围在4.57 4.07的范围内。所述菌株在42 °C发酵后，在室温储藏21d期间，pH值下降了 0.5pH单位。本专利技术还涉及所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株菌作为酸奶发酵剂的用途。另一方面，本专利技术还涉及包含权利要求2所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株菌的发酵乳、发酵食品，所述发酵食品可以是酸奶。本专利技术提供了一种控制酸奶后酸化的方法，该方法是利用硫酸新霉素诱变出具有弱H+-ATPase活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种。本专利技术通过改变野生菌株的H+-ATPase活性来改变菌种生理特性，降低菌株的生长、代谢和产酸能力，同时避免了基因工程改良菌种带来的外缘DNA问题，具有一定的安全性，能缓解酸奶的后酸化现象，提高产品的稳定性。根据本专利技术的实施方案，利用硫酸新霉素诱变具有弱H+-ATPase活性的保加利亚乳杆菌的方法是向MRS培养基中添加硫酸新霉素，硫酸新霉素在MRS培养基中的添加浓度为50-500 μ g/mL。硫酸新霉素的浓度对于控制酸奶后酸化起着非常重要作用，当MRS培养基中硫酸新霉素的浓度过低时，对控制平板上的耐硫酸新霉素菌落的数量不明显，当硫酸新霉素浓度过高时，会抑制耐硫酸新霉素菌落的生长。利用硫酸新霉素筛选出的具有弱H+-ATPas e活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种ND06-2，其在MRS培养基中培养18h后，H+-ATPase活性为0.44 μ mol/mg.min，和出发菌株相比H+-ATPase活力降低了 44%，具有弱的H+-ATPase活性。利用硫酸新霉素筛选出的具有弱H+-ATPas e活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种ND06-2作为发酵剂使用时，421:培养0、4、8、12、16、20、24、36、48和72h后，发酵乳的pH值高于出发菌株ND06发酵乳的pH值。利用硫酸新霉素筛选出的具有弱H+-ATPas e活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种ND06-2作为发酵剂使用时，42°C培养0、4、8、12、16、20、24、36、48和72h后，发酵乳的乳酸、乳糖和和半乳糖的代谢能力均低于出发菌株ND06。利用硫酸新霉素筛选出的具有弱H+-ATPase活性的保加利亚乳杆菌作为发酵剂使用时，42°C发酵后，在室温(25°C)储藏期间，发酵乳的pH值高于出发菌株ND06发酵乳的pH值。利用硫酸新霉 素筛选出的具有弱H+-ATPase活性的保加利亚乳杆菌作为发酵剂使用时，42°C发酵后，在室温(25°C)储藏期间，发酵乳的乳酸含量明显低于出发菌株发酵乳的乳酸含量。一种具有弱H+-ATPase活力的德氏乳杆菌保加利亚亚种ND06-2的制备方法:①菌种活化将_70°C保存的ND06菌株接种于脱脂乳培养基中，37°C培养24h后，在MRS培养基中传代2 3次。②硫酸新霉素溶液的配制硫酸新霉素溶液配制浓度为0.1 g/mL,经0.22 μ m膜过滤灭菌后，_20°C储存。③硫酸新霉素诱变将活化本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种具有弱H+?ATPase活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种，其特征在于所述具有弱H+?ATPase活性的保加利亚乳杆菌菌株是利用硫酸新霉素诱变德氏乳杆菌保加利亚亚种ND06（Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricusND06）后筛选获得的，德氏乳杆菌保加利亚亚种ND06，于2013年01月15日保藏在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.7133。
【技术特征摘要】
1.一种具有弱H+-ATPase活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种，其特征在于所述具有弱H+-ATPase活性的保加利亚乳杆菌菌株是利用硫酸新霉素诱变德氏乳杆菌保加利亚亚种 ND06 (LactobaciIlusdelbrueckiisubsp.bulgaricusND06)后筛选获得的，德氏乳杆菌保加利亚亚种ND06，于2013年01月15日保藏在北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCN0.7133。2.一种具有弱H+-ATPase活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株，其特征在于所述具有弱H+-ATPase活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株的分类命名为(Lactobacillusdelbrueckii subsp.bulgaricusND06_2),该菌株已于 2013 年 01 月 15 日保存于北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCN0.7134。3.权利要求2所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株在制备发酵乳、发酵食品中的应用。4.权利要求3所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株在制备发酵乳、发酵食品中的应用，其特征在于:所述菌株在42 V培养72h后，发酵乳pH值从6.44降至4，发酵乳pH值的下降幅度明显...
【专利技术属性】
技术研发人员：张和平，丹彤，
申请(专利权)人：内蒙古农业大学，
类型：发明
国别省市：
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