利用重组钝齿棒杆菌以葡萄糖为底物一步法合成γ-氨基丁酸的方法属于基因工程和酶工程领域。本发明专利技术应用基因工程方法，将钝齿棒杆菌SYPA5-5基因argB敲除，获得能够积累谷氨酸的安全菌株钝齿棒杆菌E01；从L.Plantarum?GB01-21克隆谷氨酸脱羧酶基因于钝齿棒杆菌E01中表达，获得以葡萄萄糖为底物直接合成γ-氨基丁酸的重组钝齿棒杆菌C.crenatum?E01/pGAD。重组菌发酵液γ-氨基丁酸积累量达13.98g/L。此发明专利技术成功整合谷氨酸和γ-氨基丁酸代谢途径，实现葡萄糖到γ-氨基丁酸一步法生产，简化制备途径，降低成本，提高安全性，为氨基酸的高效低成本制备提供崭新的思路。
【技术实现步骤摘要】
利用重组钝齿棒杆菌以葡萄糖为底物一步法合成Y-氨基丁酸的方法
利用基因工程技术，构建安全高效的钝齿棒杆菌工程菌。该菌以葡萄糖为底物一步法合成Y -氨基丁酸的方法，属于基因工程和酶工程领域，具体涉及基因工程重组钝齿棒杆菌生产Y-氨基丁酸的方法。技术背景Y-氨基丁酸是天然存在于某些生物体内的非蛋白质氨基酸，是哺乳动物中枢神经系统重要的抑制性神经递质，具有抗焦虑、降血压、镇定安神、增强记忆、调节激素分泌、促进生殖、利尿，镇痛等重要生理功能。在食品、饲料、医药等领域具有广泛的应用。2009年，卫生部批准Y-氨基丁酸为新资源食品，这意味着Y-氨基丁酸在国内市场跨入了一个薪新时代。目前，Y-氨基丁酸的制备主要通过化学合成法和微生物法，化学合成法反应条件剧烈，污染严重；微生物发酵法 条件温和、安全、成本较低。在微生物发酵法中，最受关注的是通过谷氨酸脱羧酶(EC4.1.1.15)催化L-谷氨酸的α-羧基脱羧来生产Y-氨基丁酸。在已报道的方法中，Y-氨基丁酸生产均需要添加外源谷氨酸作为底物，而谷氨酸是由糖质为原料经微生物发酵，采用等电点提取，离子交换树脂分离等方法制备获得。因而添加外源谷氨酸在一定程度上增加了 Y-氨基丁酸的制备成本。本实验室筛选得到的一株高产精氨酸突变菌株钝齿棒杆菌(Corynebacteriumcrenatum SYP,保藏编号CCTCC NO:M208133)，经传代5次后，获得菌株SYPA5-5，其生长特性等与母体菌SYP基本一致。将SYPA5-5中的argB基因敲除后，获得基因工程菌钝齿棒杆菌E01。该工程菌缺少Y-氨基丁酸合成途径，但能高效转化葡萄糖为谷氨酸。另外，本研究室前期经诱变筛选获得一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GBO1-21 (中国典型培养物保藏中心保藏，菌种保藏号:CCTCCM209102)，此菌株缺少谷氨酸合成途径，但具有较高的谷氨酸脱羧酶活力，能高效催化Y -氨基丁酸的合成。基于研究室前期研究基础，本专利技术首先将精氨酸高产菌株钝齿棒杆菌SYPA5-5精氨酸合成途径的关键酶基因argB敲除，获得一株能高效转化葡萄糖为谷氨酸的工程菌钝齿棒杆菌EOl。由于钝齿棒杆菌缺少GABA合成途径，本专利技术将植物乳杆菌GB01-21的谷氨酸脱羧酶基因克隆，于钝齿棒杆菌EOl中进行表达，获得了一株能以廉价的葡萄糖为底物，利用内源性谷氨酸合成Y-氨基丁酸的高效重组钝齿棒杆菌。实现了无需添加外源的谷氨酸，直接经葡萄糖一步法发酵合成Y-氨基丁酸，大大节约了 Y-氨基丁酸的制备成本。
技术实现思路
本专利技术的目的在于:敲除钝齿棒杆菌SYPA5-5精氨酸合成途径关键酶基因argB，获得谷氨酸积累菌株钝齿棒杆菌E01，将植物乳杆菌GB01-21的Y-氨基丁酸合成关键酶基因——谷氨酸脱羧酶基因进行克隆，于谷氨酸生产菌株钝齿棒杆菌EOl中异源表达，获得一株能以廉价的葡萄糖为底物，利用内源性谷氨酸高效合成Y-氨基丁酸的重组钝齿棒杆菌。该重组菌实现葡萄糖到Y-氨基丁酸的一步法生产。该专利技术为成功整合氨基酸代谢中优质酶的生物功能，简化Y-氨基丁酸的制备途径，降低其合成成本提供了一条崭新的思路。本专利技术的技术方案:以基因工程为手段，构建了一株能以廉价的葡萄糖为底物，利用内源性谷氨酸合成Y-氨基丁酸的重组钝齿棒杆菌。(I) 一株能以葡萄糖为底物，高效转化Y-氨基丁酸的重组钝齿棒杆菌，其分类命名为 C.crenatum EOl/pGAD。(2)所述重组菌的构建方法，利用携带抗生素抗性与条件致死型标记sacB双标记的新型整合型载体pK18mobsacB,通过两次同源重组敲除钝齿棒杆菌SYPA5-5精氨酸合成途径关键酶基因argB，获得工程菌钝齿棒杆菌E01，再将Ipgad基因插入到载体pJC-tac，构建得重组质粒PGAD，电击转化钝齿棒杆菌EOl，通过含有30 μ g/mL的卡那霉素抗性筛选，获得目的重组菌株C.crenatum EOl/pGAD ；①钝齿棒杆菌SYPA5-5argB基因的敲除根据GenBank中C.glutamicum ATCC13032 argB基因序列设计argB基因上下游以及中间引物，引物序列如下:PargBF:5，-CGCGAATTCATGAATGACTTGATCAAAGATTTPargBR:5，-CGCGTCGACTTACAGTTCCCCATCCTTGΡΔ argBR: 5，-CCCATCCACTAAACTTAAACACGGTTTAGCATCTCAΡΔ argBF: 5，-TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGGACTTGATTCCGGCATGA以钝齿棒杆菌SYPA5-5基因组为模板，分别以PargBF和P Λ argBR、P Δ argBF和PargBR为引物PCR，获得含21bp互补粘性末端的PCR产物，再以上述PCR产物为模板，以PargBF、PargBR为引物PCR，获得基因内部缺失约500bp的缺失型基因Λ argB。Λ argB克隆后与线性化pK18mobsacB整合型载体相连构建重组质粒pK18mobsacB_ Δ argB。将验证正确的质粒pK18mobsacB- Δ argB电击转化钝齿棒杆菌SYPA5-5，经LBG+Km固体培养基筛选，获得第一次同源重组转化子。再分别将目标转化子在含蔗糖的培养基中进行胁迫二次重组筛选，最终在LBG平板上进行划线分离并挑取多个转化子。对发生第二次同源重组的菌株进行回复野生型/基因缺失型的鉴定。提取转化子染色体，以目标基因argB的上下游引物进行PCR鉴定。鉴定正确的转化子命名为钝齿棒杆菌EOI。②植物乳杆菌GB01-21谷氨酸脱羧酶基因Ipgad的获取根据NCBI 中植物乳杆菌 Lactobacillus pi ant arum subsp.plantarumST-1II (G1:308044682)全基因组核酸序列3254376bp中的谷氨酸脱羧酶基因序列，设计正反向引物 lpgad F SalI 和 lpgad R BamHI 以 L.plantarum GB01-21 染色体为模板，IpgadF、lpgad R为引物进行PCR扩增反应，获得Ipgad基因，其全长1400bp。lpgad F Sail:5/ -CGCGTCGACATGGACCAGAAGCTGTTAAC-3'lpgad R BamHI:5/ -GGCGGATCCCAGGTGTGTTTAAAGCTGTT-3;PCR 采用 50 μ L 体系:10 X ExTaq Buffer5 μ L，dNTP4 μ L，模板 DNAl μ L，上下游引物各0.5 μ L，ExTaq酶0 .5 μ L，ddH20补齐至总体积50 μ LoPCR反应条件:94°C预变性5min ；94°C变性 50s，56°C退火 45s，72°C延伸 90s，35 个循环；72°C终延伸 lOmin，15°C IOmin0 获得lpgad基因；利用3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit (上海申能博彩生物科技有限公司)纯化DNA。③重组表达载体pGAD的构建将纯化后的PCR产物与pMD18-T连接，反应体系如下:质粒pMD1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株能以葡萄糖为底物，高效转化葡萄糖为谷氨酸的基因工程菌钝齿棒杆菌E01。
【技术特征摘要】
1.一株能以葡萄糖为底物，高效转化葡萄糖为谷氨酸的基因工程菌钝齿棒杆菌EOl。2.权利要求1中基因工程菌钝齿棒杆菌EOl的构建思路，其特征是利用一株高产精氨酸突变菌株纯齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum SYP,保藏编号 CCTCC NO:M208133),经传代5次后，敲除argB基因，获得基因工程菌钝齿棒杆菌E01，该工程菌缺少Y -氨基丁酸合成途径，但能高效催化葡萄糖转化为谷氨酸。3.一株能以葡萄糖为底物，高效转化Y-氨基丁酸的重组钝齿棒杆菌，其分类命名为C.crenatum E01/pGADo4.权利要求书3中的重组菌C.crenatum EOl/pGAD的构建思路,其特征是根据植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GBO1-21 (中国典型培养物保藏中心保藏,保藏号:CCTCCM209102)谷氨酸合成途径，但具有较高的谷氨酸脱羧酶活力，能高效催化Y _氨基丁酸的合成，以及权利要求1中的钝齿棒杆菌EOl缺少Y-氨基丁酸合成途径，但能高效催化葡萄糖转化为谷氨酸的特点，该重组菌成功重组了钝齿棒杆菌的谷氨酸代谢途径和植物乳杆菌的Y-氨基丁酸合成途径，获得能以葡萄糖为底物，生物转化Y-氨基丁酸的高效重组钝齿棒杆菌。5.权利要求书3中的重组菌C.crenatum EOl/pGAD的构建方法，其特征是将植物乳杆菌的Ipgad基因插入到载体pJC-tac,构建得重组质粒pGAD,电击转化钝齿棒杆菌E01,通过含有30 μ g/mL的卡那霉素抗性筛选,获得目的重组菌株C.crenatum EOl/pGAD。6.权利要求书3中的重组质粒pGAD的构建，其特征是将纯化后的Ipgad基因与pMD18-T连接，反应体系如下:质粒pMD18-T0.5 μ L，目的基因4.5 μ L，LigationSolution5yL，混合连接液，将其置于16°C培养箱中连接4h以上，转化大肠杆菌JM109，提取质粒pMD18-T-lpgad,酶切验证并测序,提取质粒pMD18-T_lpgad和表达载体pJC-tac, 二者同时用Sal I/BamH I双酶切，酶切产物通过粘性末端连接，获得重组质粒pGAD。7.权利要求5中的Ipgad基因的获得，其特征是以保藏编号为CCTCCM209102的L.plantarum GB01-21 为模板，设计正反向引物 lpgad F Sal I 和 lpgad R BamH I (如下所示)，以L.plantarum GB01-21染色体为模板，lpgad F、lpgad R为引物进行PCR扩增反应，PCR 采用 50yL 体系...
【专利技术属性】
技术研发人员：饶志明，孙红梅，徐美娟，李秀鹏，张显，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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