谷氨酸棒杆菌突变株及其在L-亮氨酸生产中的应用制造技术

本发明专利技术公开一株谷氨酸棒杆菌突变株及其在L‑亮氨酸生产中的应用。所述的谷氨酸棒杆菌突变株，保藏编号为CGMCC No.15720。利用上述本发明专利技术的突变菌株及发酵方法，可以实现L‑亮氨酸的高效生产，并且在发酵生产的过程中，有效降低副酸产量。进一步由于发酵液中杂酸少，提纯过程中无需按照本领域常规方案添加晶种、洗晶剂或结晶助剂，也无需重结晶步骤。发酵液通过简单的分离提取，产品纯度高。整个生产工艺过程简单易控制，成本较低，适合大规模工业应用。

【技术实现步骤摘要】
谷氨酸棒杆菌突变株及其在L-亮氨酸生产中的应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及用于L-亮氨酸生产的谷氨酸棒杆菌突变菌株及其在微生物发酵工程中的应用。
技术介绍
L-亮氨酸是人与动物自身无法合成而需依赖外源供给的八大必需氨基酸之一，L-亮氨酸具有多种生理功能，是临床上复合氨基酸静脉注射液不可缺少的原料，对维持危重病人的营养需要有积极的作用。另外，L-亮氨酸与L-缬氨酸、L-异亮氨酸同属于支链氨基酸，在食品、保健品、饲料等方面也有广泛的应用。目前国内L-亮氨酸的生产工艺大多采用水解法，存在环境污染严重等问题。国内发酵法生产L-亮氨酸技术起步较晚且技术落后，与日本等国家相比仍存在一定的差距，原因就在于菌株遗传信息不稳定、培养工艺粗放、杂酸多影响产品收率和纯度等。因此，选育L-亮氨酸高产菌株，提高产酸水平、糖酸转化率和提取收率，降低生产成本，才能提高国内产品的市场竞争力。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供可用于L-亮氨酸生产的高效高产菌株，并提供利用其进行发酵生产L-亮氨酸的方法。首先，本专利技术提供一株谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)突变株IBBH-15，保藏于位于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.15720，保藏日期为2018年05月02日。本专利技术的上述突变株是以谷氨酸棒杆菌(CICC编号20193)为出发菌株，通过诱变筛选的得到的高产L-亮氨酸、副酸少的突变菌株。经检测，该所述的谷氨酸棒杆菌突变株的遗传标记为谷氨酸缺陷(Glu-)、甲硫氨酸缺陷(Met-)、异亮氨酸缺陷(Ile-)、2-噻唑丙氨酸抗性(2-TAr)、磺胺胍(SGr)和β-羟基亮氨酸抗性(β-HLr)。进一步，本专利技术提供一种L-亮氨酸的生产方法，是微生物发酵的生产方法，该方法包括使用上述的谷氨酸棒杆菌突变株进行微生物发酵的步骤。利用上述本专利技术的突变菌株及发酵方法，可以实现L-亮氨酸的高效生产，并且在发酵生产的过程中，有效降低副酸产量。进一步由于发酵液中杂酸少，提纯过程中无需按照本领域常规方案添加晶种、洗晶剂或结晶助剂，也无需重结晶步骤。发酵液通过简单的分离提取，产品纯度高。整个生产工艺过程简单易控制，成本较低，适合大规模工业应用。具体实施方式本专利技术提供了一株高产L-亮氨酸且副酸少的谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)突变株(CGMCCNo.15720)。本专利技术对上述突变株的诱变及选育是以谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum，CICC编号20193)为出发菌株，通过紫外及硫酸二乙酯两步诱变，并经选育、筛选得到高产L-亮氨酸且副酸少的生产菌株IBBH-15，其遗传标记为谷氨酸缺陷(Glu-)、甲硫氨酸缺陷(Met-)、异亮氨酸缺陷(Ile-)、2-噻唑丙氨酸抗性(2-TAr)、磺胺胍(SGr)、β-羟基亮氨酸抗性(β-HLr)。具体的诱变剂选育过程将具体描述如下。如无特殊说明，本专利技术中所述及的培养基如下：完全培养基(CM)：葡萄糖5g/L，牛肉膏10g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠5g/L，pH7.0～7.2。基本培养基(MM)：葡萄糖20g/L，硫酸铵2.0g/L，尿素2.0g/L，K2HPO40.5g/L，KH2PO40.5g/L，MgSO4·7H2O0.25g/L，FeSO4·7H2O0.01g/L，MnSO4·H2O0.01g/L，生物素100μg/L，维生素B1100μg/L，pH7.0～7.2。补充培养基(SM)：在基本培养基(MM)中加入支链氨基酸的结构类似物。无氮基本培养基：葡萄糖20g/L，K2HPO40.5g/L，KH2PO40.5g/L，MgSO4·7H2O0.25g/L，FeSO4·7H2O0.01g/L，MnSO4·H2O0.01g/L，生物素100μg/L，维生素B1100μg/L，pH7.0～7.2。2倍氮基本培养基：葡萄糖20g/L，硫酸铵4.0g/L，尿素2.0g/L，K2HPO40.5g/L，KH2PO40.5g/L，MgSO4·7H2O0.25g/L，FeSO4·7H2O0.01g/L，MnSO4·H2O0.01g/L，生物素100μg/L，维生素B1100μg/L，pH7.0～7.2。摇瓶发酵培养基：葡萄糖130g/L，硫酸铵30g/L，玉米浆15mL/L，K2HPO45g/L，MgSO4·7H2O2.5g/L，FeSO4·7H2O0.01g/L，MnSO4·H2O0.01g/L，生物素200μg/L，维生素B1300μg/L，CaCO335g/L，pH7.0～7.2。诱变选育的过程包括如下步骤：(1)诱变前处理：取一环活化的菌种(CICCNo.20193)接入装有25ml液态完全培养基的锥形瓶中，置于30℃、80～90rpm的往复式摇床中振荡培养16～20h。再取1培养液接入另一盛有25ml液态完全培养基的锥形瓶中，置于30℃、80～90rpm的往复式摇床中振荡4～6h，至细胞处于对数生长期。(2)菌悬液的制备取10ml步骤(1)所制得的培养液于无菌离心管中，5000rpm离心10min，弃去上清液，采用生理盐水重悬细胞后倒入锥形瓶中，振荡10min，调整细胞浓度为5×108个/ml。(3)紫外诱变取步骤(2)所制得的菌悬液于30W紫外灯下诱变30～120s，每隔10s取样稀释涂布，平板避光培养后计算致死率。采用饥饿培养和青霉素法淘汰野生型、浓缩缺陷型，通过影印培养法检出缺陷型菌株(Glu-+Met-+Ile-)，并按步骤(5)检验发酵产酸能力。(4)硫酸二乙酯诱变将步骤(3)所制得的缺陷型菌株按步骤(1)和步骤(2)制备菌悬液，加入0.5％(V％)的硫酸二乙酯(DES)，30℃振荡处理20min，中止处理后涂布于SM平板上，30℃静止培养4～6天。挑选在SM上生长的突变株单菌落转接至添加了5～10g/L2-噻唑丙氨酸、10～20g/L磺胺胍或5～10g/Lβ-羟基亮氨酸的CM平板上，30℃静止培养24小时后进入摇瓶复筛。(5)摇瓶复筛将四环步骤(3)或步骤(4)获得的突变株接种于摇瓶发酵培养基中，30℃、100rpm振荡培养72小时，然后用纸层析法检测突变株发酵液中积累的L-亮氨酸。在所有突变株中产L-亮氨酸最高的菌株为IBBH-15。以该菌株为发酵菌株，本专利技术进一步提供了一种L-亮氨酸的生产方法。该方法中包括了使用上述谷氨酸棒杆菌突变株CGMCCNo.15720进行微生物发酵的步骤。进一步，通过对发酵过程中温度、pH、溶解氧的控制，以及培养基的组成和添加方式进行调整，在500L发酵罐上实现发酵周期由67h缩短至48h，将L-亮氨酸产量由30g/L增加到40g/L，并且副酸总含量＜3g/L。用于实现该技术效果的具体实施方式之一，是包括下述步骤的方法：(1)制备摇瓶种子液：将谷氨酸棒杆菌突变株接入摇瓶种子培养基中，30℃、100rpm振荡培养至OD600＝10～15，得到摇瓶种子液；摇瓶种子培养基：葡萄糖30g/L，玉米浆40mL/L，硫酸铵25g/L，尿素2g/L，KH2PO4·3H2O1g/L，MgSO4·本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.谷氨酸棒杆菌突变株，保藏编号为CGMCC No.15720。

【技术特征摘要】
1.谷氨酸棒杆菌突变株，保藏编号为CGMCCNo.15720。2.根据权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌突变株，其特征在于，其遗传标记为谷氨酸缺陷、甲硫氨酸缺陷、异亮氨酸缺陷、2-噻唑丙氨酸抗性、磺胺胍和β-羟基亮氨酸抗性。3.L-亮氨酸的生产方法，是微生物发酵的生产方法，其特征在于，包括使用权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌突变株进行微生物发酵的步骤。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)制备摇瓶种子液：将谷氨酸棒杆菌突变株接入摇瓶种子培养基中，30℃、100rpm振荡培养至OD600＝10～15，得到摇瓶种子液；摇瓶种子培养基：葡萄糖30g/L，玉米浆40mL/L，硫酸铵25g/L，尿素2g/L，KH2PO4·3H2O1g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，FeSO4·7H2O0.01g/L，MnSO4·H2O0.01g/L，生物素(VH)100...

【专利技术属性】
技术研发人员：范超，洪皓，刘军，陈剑彬，吴文忠，
申请(专利权)人：大连医诺生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁,21