本发明专利技术涉及一株能提高草鱼生长性能、免疫能力并调节肠道菌群结构的地衣芽孢杆菌FA6及其应用，属于菌种领域。本发明专利技术从健康草鱼的肠道内分离出一株地衣芽孢杆菌，命名为地衣芽孢杆菌(Bacillus lincheniformis)FA6，已于2018年6月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：M2018410。本发明专利技术的菌株可以用于制备水产用微生态制剂或饲料添加剂，研究表明本发明专利技术的地衣芽孢杆菌FA6能够在草鱼肠道长期定植，在草鱼的饲料饲料中添加该地衣芽孢杆菌可提高草鱼的生长性能，增强草鱼的免疫能力，改变草鱼肠道微生物群落结构，为一种具有良好应用前景的菌株。
【技术实现步骤摘要】
一株能提高草鱼生长性能、免疫能力并调节肠道菌群结构的地衣芽孢杆菌FA6及其应用
本专利技术属于菌种领域，涉及一种地衣芽孢杆菌，更具体地说，本专利技术涉及一株能提高草鱼生长性能、免疫能力并调节肠道菌群结构的地衣芽孢杆菌FA6及其应用。
技术介绍
地衣芽孢杆菌FA6为革兰氏阳性兼性厌氧菌，细胞呈杆状，大小一般为(0.6～0.8)μm×(1.5～3.0)μm，能生成呈椭圆形或柱状的芽孢，中生或偏中生，孢囊不膨大或轻微膨大；在LB培养基上形成扁平、边缘不整齐、表面皱褶的白色菌落；地衣芽孢杆菌对外界环境有较强的抵抗力，对高温、酸性、胆汁酸有较强的耐受能力，我国已将其纳入《饲料添加剂品种录(2013)》中，是较具应用潜力的菌种之一。草鱼是中国四大家鱼之一，是我国重要的经济鱼类。FAO统计显示，草鱼在2007年以后超过鲢鱼成为世界范围内水产养殖产量最高的品种。其养殖产量在我国也是在逐年增加，在2016年达到了590万吨。随着水产养殖业的迅速发展和集约化程度的提高，其带来的水环境污染，养殖鱼类病害及水产品质量安全已成为制约我国水产经济发展的重要问题。水质污染除了陆源性污染外，饲料也是重要污染源之一，同时抗生素不合理的大量使用也很容易造成养殖鱼类肠道菌群失调、二次感染、耐药菌株产生、药物残留和环境污染等危害。目前，在水产养殖和饲料添加剂中，使用地衣芽孢杆菌具有以下优点和特点：①地衣芽孢杆菌能够产生淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、脂肪酶以及能代谢产生多种氨基酸和短链脂肪酸；②地衣芽孢杆菌可以在进入肠道后，迅速复活，定植在动物消化道，占据生态位，同时其夺氧效应能消耗大量的氧气，维持肠道厌氧环境，抑制致病菌的生长，维持肠道正常生态平衡。③具有耐高温、耐酸碱等特点，能够减少颗粒饲料加工对其活性的影响；④在贮藏过程中以休眠的孢子形式存在，能够长期保存，不消耗饲料的营养成分，可以保证饲料的质量；因此，地衣芽孢杆菌及其微生态制剂及饲料添加剂能较好的改善水产养殖中病害频发、滥用抗生素、产生大量污染等问题，其健康无污染的特点使其值得广泛推广。但是，迄今，还没有一株地衣芽孢杆菌能够在肠道长期定植，持续发挥促生长，提高免疫功能的作用。基于此，特提出本申请。
技术实现思路
本专利技术针对
技术介绍
中所指出的问题及现有技术存在的不足，本专利技术的第一目的在于提供一株能提高草鱼生长性能、免疫能力并调节肠道菌群结构的地衣芽孢杆菌FA6，本专利技术的第二个目的在于提供上述地衣芽孢杆菌FA6的分离筛选方法，本专利技术的第三个目的在于提供上述所述地衣芽孢杆菌FA6的应用，可用于制备微生态制剂或饲料添加剂饲养草鱼。为了实现本专利技术上述第一个目的，本专利技术采用的技术方案为：一株能提高草鱼生长性能、免疫能力并调节肠道菌群结构的地衣芽孢杆菌FA6，其分类命名为：地衣芽孢杆菌(Bacilluslincheniformis)FA6，已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，其保藏编号是：CCTCCNO：M2018410，保藏日期：2018年6月29日。本专利技术所述的地衣芽孢杆菌FA6，是从草鱼胃肠道内容物中分离获得的菌株，所述地衣芽孢杆菌FA6对外界环境有较强的抵抗力，对高温和胆汁酸有较强的耐受能力，能在肠道长期定植，促进水产动物生长，提高免疫力及改善肠道菌群，为一种具有良好应用前景的菌株。本专利技术上述所述的地衣芽孢杆菌(Bacilluslincheniformis)FA6还具有如下性质：1、微生物学特征地衣芽孢杆菌FA6为革兰氏阳性兼性厌氧菌，细胞呈杆状，大小一般为(0.6～0.8)μm×(1.5～3.0)μm，能生成呈椭圆形或柱状的芽孢，中生或偏中生；在LB培养基上形成扁平、边缘不整齐、表面皱褶的白色菌落，菌落形态如图1所示。2、16SrRNA分析利用细菌的通用引物对筛选到的菌株进行PCR鉴定：按细菌DNA提取试剂盒操作说明书提取模板DNA。使用16SrRNA保守序列的上游引物27F：5ˊ-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3ˊ(如SEQIDNo.2所示)和下游引物1492R：5ˊ-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3ˊ(如SEQIDNo.3所示)，对地衣芽孢杆菌FA6的16SrRNA基因片段进行PCR扩增，并将扩增产物用琼脂糖凝胶纯化试剂盒进行回收，回收产物用pMD-18T载体连接转化到DH5α感受态细胞中，涂布于57mg/ml氨苄青霉素LB培养基上，37℃培养10h。随机挑选转化子，用载体通用引物M13R：5ˊ-CAGGAAACAGCTATGACC-3ˊ(如SEQIDNo.4所示)和M13F：5ˊ-TGTAAAACGACGGCCAGT-3ˊ(如SEQIDNo.5所示)，进行检测并测序，测序后获得1444bp的片段，在GenBank的登录号为MG428771.1，经测序可知该菌为地衣芽孢杆菌，该菌的16SrRNA基因序列如SEQIDNo.1。为了实现本专利技术的另一目的，本专利技术提供上述所述的地衣芽孢杆菌FA6的分离筛选方法，所述方法主要包括以下步骤：(1)样品采集采集长江中游黄冈段草鱼样品，将草鱼肠道排空，置于解剖盘中，酒精消毒体表后解剖草鱼，然后用细线将草鱼肠道按前肠、中肠、后肠分段结扎，取出肠道，剥离肠道外壁脂肪，转移至厌氧手套箱中，待厌氧手套箱中H2和O2含量稳定后开始采集各段肠黏膜，再将各部分肠道纵向剪开，用PBS缓冲液漂洗后轻轻刮取黏膜，置于离心管中；(2)厌氧条件下细菌的分离向步骤(1)中装有黏膜样品的离心管中加入PBS缓冲液，充分混匀后，转移到另一盛有PBS缓冲液的离心管中进行梯度稀释，然后将梯度稀释后的黏膜匀浆液均匀涂布到BHIA培养基表面，在28℃条件下厌氧培养48h，最后从培养基上挑取单菌落接种在BHIA液体培养基中，继续在28℃条件下震荡培养48～72h；(3)菌株筛选与鉴定在无菌操作台上从步骤(2)震荡培养后的BHIA液体培养基中吸取少量培养液于装有磁珠的离心管中，涡旋2～5min，随后以菌液为模板，用细菌通用引物27F，1492R进行细菌16SrRNA扩增；扩增产物凝胶电泳后用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒对1500bp的条带进行回收，回收产物用pMD-18T载体连接转化到DH5α感受态细胞中，涂布于氨苄青霉素LB培养基上，37℃培养10h，随机挑选转化子，再用载体通用引物M13F和M13R检测质粒是否插入成功，对检测结果条带大小为1700bp的单克隆送测序；(4)样品菌株扩大培养与保存将测序结果导入NCBI数据库进行比对，将比对结果为地衣芽孢杆菌的样品菌株接种到LB培养基进行扩大培养，同时将其接种到20％甘油LB培养基中，置于-80℃超低温冰箱进行保存。为了实现本专利技术的第三个目的，本专利技术提供上述所述地衣芽孢杆菌FA6的应用，可用于制备微生态制剂或饲料添加剂饲养草鱼。所述的地衣芽孢杆菌FA6作为水产用微生态制剂的应用。所述的地衣芽孢杆菌FA6作为饲料添加剂的应用。上述所述地衣芽孢杆菌FA6微生态制剂的制备方法，具体步骤如下：将所述地衣芽孢杆菌FA6接种到种子培养基中，扩培后再接种到发酵培养基中进行发酵，然后对所得发酵液进行芽孢染色，当芽孢率达95％时停止发酵，最后将发酵所得菌液进行离心收集菌体，加入保护剂后干燥，即制得所述地衣本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一株能提高草鱼生长性能、免疫能力并调节肠道菌群结构的地衣芽孢杆菌FA6，其特征在于：其分类命名为：地衣芽孢杆菌(Bacillus lincheniformis)FA6，已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，其保藏编号是：CCTCC NO：M2018410，保藏日期：2018年6月29日。
【技术特征摘要】
1.一株能提高草鱼生长性能、免疫能力并调节肠道菌群结构的地衣芽孢杆菌FA6，其特征在于：其分类命名为：地衣芽孢杆菌(Bacilluslincheniformis)FA6，已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，其保藏编号是：CCTCCNO：M2018410，保藏日期：2018年6月29日。2.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌FA6的分离筛选方法，其特征在于：所述方法主要包括以下步骤：(1)样品采集采集长江中游黄冈段草鱼样品，将草鱼肠道排空，置于解剖盘中，酒精消毒体表后解剖草鱼，然后用细线将草鱼肠道按前肠、中肠、后肠分段结扎，取出肠道，剥离肠道外壁脂肪，转移至厌氧手套箱中，待厌氧手套箱中H2和O2含量稳定后开始采集各段肠黏膜，再将各部分肠道纵向剪开，用PBS缓冲液漂洗后轻轻刮取黏膜，置于离心管中；(2)厌氧条件下细菌的分离向步骤(1)中装有黏膜样品的离心管中加入PBS缓冲液，充分混匀后，转移到另一盛有PBS缓冲液的离心管中进行梯度稀释，然后将梯度稀释后的黏膜匀浆液均匀涂布到BHIA培养基表面，在28℃条件下厌氧培养48h，最后从培养基上挑取单菌落接种在BHIA液体培养基中，继续在28℃条件下震荡培养48～72h；(3)菌株筛选与鉴定在无菌操作台上从步骤(2)震荡培养后的BHIA液体培养基中吸取少量培养液于装有磁珠的离心管中，涡旋2～5min，随后以菌液为模板，用细菌通用引物27F，1492R进行细菌16SrRNA扩增；扩增产物凝胶电泳后用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒对1500bp的条带进行回收，回收产物用pMD-18T载体连接转化到DH5α感受态细胞中，涂布于氨苄青霉素LB培养基上，37℃培养10h，随机挑选转化子，再用载体通用引物M13F和M1...
【专利技术属性】
技术研发人员：王桂堂，秦路，向金花，吴山功，邹红，李明，李文祥，
申请(专利权)人：中国科学院水生生物研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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