一种内切葡聚糖酶及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种内切葡聚糖酶及其编码基因与应用，其中内切葡聚糖酶CelA，是由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。本发明专利技术通过对关键的内切葡聚糖酶CelA其氨基酸序列、用于编码该内切葡聚糖酶CelA的基因序列等进行改进，与现有技术相比可以克服现有微生物来源的内切葡聚糖酶普遍酶活不高、催化效率偏低等问题，该内切葡聚糖酶CelA可广泛应用于生物质能源、食品、饲料、纺织等工业领域的高效内切葡聚糖酶，尤其可以应用于苎麻生物脱胶过程中，能够提高麻纤维脱胶率。

【技术实现步骤摘要】
一种内切葡聚糖酶及其编码基因与应用
本专利技术属于基因工程领域，尤其是葡聚糖酶CelA的分离及应用
，更具体地，涉及一种内切葡聚糖酶及其编码基因与应用，该内切葡聚糖酶CelA可应用于苎麻生物脱胶过程中，本专利技术还涉及该该酶的纯化。
技术介绍
自然界中，木质纤维素生物质是地球上蕴藏量最丰富的可再生的天然生物质资源，主要包括40-50％纤维素、25-30％半纤维素和15-20％木质素(KnaufM,MoniruzzmanM.Lignocellulosicbiomassprocessing:aperspective.InternationalSugarJournal2004,106:147-150.)。其中植物细胞壁，如苎麻、亚麻、红麻等，是天然的木质纤维素复合材料，纤维素被包裹在果胶，半纤维素和木质素基质中，在精干麻清洁生产过程中除果胶外，对于半纤维、非结晶纤维素和木质素等的降解也显得尤为重要，是亟待解决的关键技术难题(FanP,HeF,YangY,AoMZ,OuyangJ,LiuY,YuLJ.In-situmicrobialdegummingtechnologywithBacillussp.HG-28forindustrialproductionoframiefibers.BiochemicalEngineeringJournal2015,97:50-58.)。内切葡聚糖酶(endo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.4)，随机定位于为纤维素上的非结晶区，水解主链上连接葡萄糖残基之间的β-1,4糖苷键产生大量的还原端，分子量范围约为23-146kDa。属于GH5家族的内切葡聚糖酶包括两个结构域，即活性区和碳水化合物结合域(CBM3)，而活性区为(α/β)8桶状结构，通常具有多功能性，能够水解多种底物，包括几丁质、甘露聚糖、纤维素、木聚糖、葡聚糖和地衣多糖(ElifantzH,WaidnerLA,MichelouVK,CottrellMT,KirchmanDL.Diversityandabundanceofglycosylhydrolasefamily5intheNorthAtlanticOcean.FemsMicrobiologyEcology2008,63:316-327.)。来源于Erwiniacarotovorasubspeciescarotovora(Ecc)的纤维素酶CelV(GenBankaccessionno.2009365A)属于糖苷水解酶类第5家族，最适温度为42℃，最适pH为7.0，不仅对CMCNa具有水解活性，且对部分木聚糖也具有一定的活性(CooperVJC,SalmondGPC.Molecularanalysisofthemajorcellulase(CelV)ofErwiniacarotovora:evidenceforanevolutionary“mix-and-match”ofenzymedomains.MolecularandGeneralGenetics1993,241:341-350.)。现有微生物来源的胞外关键脱胶酶普遍存在酶活不高、产量偏低等问题，导致脱胶效果不稳定以及达不到麻纺对纤维残胶率的要求。另外野生型菌株对生长条件要求较苛刻，竞争生存能力较差，工业条件应用推广不够广泛(谢莉敏,陈桂华,吴晓玉,王园秀.苎麻脱胶工艺的研究进展[J].江苏农业科学,2012,40:226-228.)。因此获得高效且性能优良的多功能糖苷水解酶并将其应用诸如苎麻生物脱胶等势在必行。
技术实现思路
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本专利技术的目的在于提供一种内切葡聚糖酶及其编码基因与应用，其中通过对关键的内切葡聚糖酶CelA其氨基酸序列、用于编码该内切葡聚糖酶CelA的基因序列等进行改进，与现有技术相比可以克服现有微生物来源的胞外关键脱胶酶普遍酶活不高、产量偏低等问题，本专利技术可以实现该内切葡聚糖酶CelA的工业化生产，能够得到具有很好应用前景的内切葡聚糖酶的生产菌种，非常利于内切葡聚糖酶CelA的推广应用。本专利技术可以采用基因工程方法制备内切葡聚糖酶，得到的内切葡聚糖酶CelA可应用于各个领域，是一种新的能够广泛应用于生物质能源、食品、饲料、纺织等工业领域的高效内切葡聚糖酶，尤其可以应用于苎麻生物脱胶过程中，提高麻纤维脱胶率，降低麻纺织品刺痒感。为实现上述目的，按照本专利技术的一个方面，提供了一种内切葡聚糖酶CelA，其特征在于，该内切葡聚糖酶是由SEQIDNO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。按照本专利技术的另一方面，本专利技术提供了一种用于编码上述内切葡聚糖酶CelA的基因。作为本专利技术的进一步优选，所述基因具有如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。按照本专利技术的又一方面，本专利技术提供了包含上述基因的重组载体。作为本专利技术的进一步优选，所述重组载体具体为pET32a-celA，是通过将上述基因CelA插入到表达载体pET32a内的限制性内切酶位点NcoI和HindIII之间获得的。按照本专利技术的又一方面，本专利技术提供了包含上述基因的重组菌株。按照本专利技术的又一方面，本专利技术提供了制备上述内切葡聚糖酶CelA的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以上述重组载体转化宿主细胞，获得重组菌株；(2)发酵该重组菌株，获得表达的内切葡聚糖酶CelA；(3)收集并纯化所表达的内切葡聚糖酶CelA。按照本专利技术的再一方面，本专利技术提供了上述内切葡聚糖酶CelA的应用，其特征在于，该应用具体是应用于酿酒、造纸、纺织或饲料制备中，优选是应用于苎麻中。通过本专利技术所构思的以上技术方案，与现有技术相比，由于对内切葡聚糖酶CelA其氨基酸序列、用于编码该内切葡聚糖酶CelA的基因序列等进行改进，可有效解决现有微生物来源的内切葡聚糖酶普遍酶活不高、催化效率偏低等问题。本专利技术涉及葡聚糖酶基因的异源表达及应用，具体涉及基因克隆一种新的来源于胡萝卜软腐果胶杆菌PectobacteriumcarotovorumHG-49的葡聚糖酶CelA及其基因和应用。本专利技术中的葡聚糖酶CelA，优选具有如SEQIDNO.2所示氨基酸序列，且本专利技术提供编码该酶的基因，优选具有如SEQIDNO.1所示核苷酸序列，此外本专利技术还提供了包含该基因的重组载体pET32a-celA和重组菌株E.coliBL21-CelA。本专利技术可以从胡萝卜软腐果胶杆菌PectobacteriumcarotovorumHG-49中克隆获得内切葡聚糖酶基因celA构建了能够高效表达该内切葡聚糖的重组大肠杆菌，并且纯化后的酶尤其可应用于苎麻生物脱胶过程中。可以将本专利技术的内切葡聚糖酶基因(如核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的内切葡聚糖酶基因)插入到表达载pET32a内限制性酶切位点NcoI和HindIII之间，使该核苷酸序列与载体表达调控序列相连接，可获得重组表达载体pET32a-celA。本专利技术还可以包含上述内切葡聚糖酶基因celA的重组菌株，菌株可以优选为重组大肠杆菌，例如可以为重组菌株E.coliBL21/celA。可将本专利技术中的内切葡聚糖酶基因CelA成熟编码序列及推导出的氨基酸序列进行Blast比对，确定该酶CelA是一种新的内切葡聚糖酶。本专利技术中，来源于胡萝本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种内切葡聚糖酶CelA，其特征在于，该内切葡聚糖酶是由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.一种内切葡聚糖酶CelA，其特征在于，该内切葡聚糖酶是由SEQIDNO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。2.一种用于编码如权利要求1所述内切葡聚糖酶CelA的基因。3.如权利要求2所述基因，其特征在于，所述基因具有如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。4.一种包含如权利要求2或3所述基因的重组载体。5.如权利要求4所述重组载体，其特征在于，所述重组载体具体为pET32a-celA，是通过将如权利要求2或3所述基因CelA插入到表达载体pET32a内的限制性...

【专利技术属性】
技术研发人员：余龙江，王亚伟，白云，舒潼，向梦雄，王慧慧，李攀登，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42