一种β-1,4-葡聚糖酶编码基因及其制备与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种来源于多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)的内切β‑1,4‑葡聚糖酶基因及其酶的制备方法与应用，即利用基因工程的技术方法，将该内切β‑1,4‑葡聚糖酶的基因克隆到大肠杆菌表达载体上，获得可异源表达该酶的大肠杆菌重组菌株，该菌株异源表达制备的内切β‑1,4‑葡聚糖酶，能高效降解魔芋多糖(又称魔芋葡甘聚糖)。本发明专利技术提供的内切β‑1,4‑葡聚糖酶可广泛应用于农业、食品、饲料添加剂、医药及葡甘露低聚糖制备等领域。

A beta -1,4- glucan gene encoding gene and its preparation and Application

The invention discloses a preparation method and application of endo-beta-1,4-glucanase gene and its enzyme from Paenibacillus polymyxa, i.e. the gene of endo-beta-1,4-glucanase is cloned on the expression vector of E.coli by means of genetic engineering technology, and the heterologous expression of the gene is obtained. Enzyme recombinant E. coli strain, the strain heterologous expression preparation of endo-beta-1,4-glucanase, can efficiently degrade konjac polysaccharide (also known as konjac glucomannan). The endo-beta-1,4-glucanase provided by the invention can be widely used in agriculture, food, feed additives, medicine, preparation of glucomannan oligosaccharides and other fields.

【技术实现步骤摘要】
一种β-1,4-葡聚糖酶编码基因及其制备与应用
本专利技术涉及一种内切β-1,4-葡聚糖酶的基因序列及其制备方法和应用。本专利技术提供了该内切β-1,4-葡聚糖酶的重组质粒和重组基因工程菌株及其在多糖降解方面的应用。本专利技术提供的内切β-1,4-葡聚糖酶可广泛应用于农业、食品、饲料添加、医药及寡糖制备等领域。
技术介绍
蒟蒻(Amorphophalluskonjac)，俗称魔芋，天南星科魔芋属多年生草本植物。魔芋中主要成分为魔芋多糖(又称魔芋葡甘露聚糖)，由葡萄糖与甘露糖组成。魔芋葡甘露聚糖通过β-1,4吡喃糖苷键将β-D-葡萄糖和β-D-甘露糖按1∶1.6或1∶1.69的摩尔比连接而成，每19个糖残基上有一个乙酰基团存在，其特殊的结构使其虽具有多种生物学功能。但是其在水中为胶体，粘度大、溶解度小，在后续加工利用上带来不便；其在各种食品中添加量小，影响了其生物活性。目前我国魔芋产业多停留在魔芋初级食品开发层面，亟需高值化加工技术，对魔芋主要成分魔芋葡甘露聚糖的深加工是魔芋下游产业的主要方向。将魔芋多糖降解成魔芋寡糖，即魔芋葡甘露寡糖(Konjacoligo-glucomannan，KOGM)，其分子量小，在水中可溶，易于吸收，将会克服魔芋多糖在加工利用中问题。与魔芋多糖相比，魔芋寡糖具有优良的性能，具有改善食品品质，保鲜食品，改善人体肠道菌群，增强免疫力，调节血糖、血脂以及肠道解毒等生物活性。生理功能试验表明，葡甘露低聚糖除了具有低热量、稳定、安全无毒等良好的理化特性外，还具有促进以双歧杆菌为代表的有益菌群的增殖,改善肠道内菌群结构；减慢肠道粘膜分泌的β-糖苷酶的扩散速度，不升高血糖，提高机体抗氧化能力等功能。目前尚无大量工业生产魔芋葡甘低聚糖的报道，其生产尚停留在实验室研究期间，获得葡甘低聚糖的方法主要有以下几种：(1)从天然原料(魔芋)中提取，但提取工艺复杂，且产率极低；(2)通过人工化学合成的方法获得，但此法步骤繁琐，成本太高；(3)利用酸水解魔芋葡甘露聚糖的方法获得，但这样生产的低聚糖性质不稳定，副产品多，不易得到特定的低聚糖；(4)利用物理方法降解得到，但此方法要利用现代化的生产设备，实验设备要求太高，不利于大量生产；(5)利用酶解葡甘露聚糖的方法获得，酶的反应效率高，方法简单、易控制，后期分离也容易，且酶作为一种生物制剂，不会带来化学试剂产生的不利因素。所以利用酶解葡甘露聚糖的方法生产葡甘露低聚糖是一条相对简单，容易研究的生产方法。葡甘聚糖酶(glucomannanase)是一种能够将葡甘聚糖降解为葡甘低聚糖的酶，根据葡甘聚糖的结构，大部分的研究报道是葡甘聚糖酶的类似酶——甘露聚糖酶，而对于葡聚糖酶(纤维素酶)的研究相对较少。目前，对葡聚糖酶的研究多集中于纤维素类底物降解方面，而对半纤维素类底物(如魔芋)的研究相对较少。且已报道的葡聚糖酶对魔芋多糖的降解活性均较弱，不适于大规模应用。因此，寻找一种能够高效降解魔芋多糖的葡聚糖酶是降低葡甘露寡糖生产成本的有利途径。而由于葡聚糖酶在生物体内的含量非常少，借助基因水平进行高量表达和表征是提高葡聚糖酶产量的一种有效措施。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种新型的来源于多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)的内切β-1,4-葡聚糖酶Ppglu及其编码基因。本专利技术的第二个目的是提供一种制备新型内切β-1,4-葡聚糖酶Ppglu的方法。本专利技术的第三个目的是提供含有所述的内切β-1,4-葡聚糖酶Ppglu基因重组表达质粒和重组基因工程菌株。本专利技术的第四个目的是提供一种新型内切β-1,4-葡聚糖酶Ppglu在魔芋多糖降解中的应用。本专利技术所提供的内切β-1,4-葡聚糖酶Ppglu，来源于土壤中分离纯化的多粘类芽孢杆菌Paenibacilluspolymyxa，从中扩增出的内切β-1,4-葡聚糖酶Ppglu编码基因(命名为Ppglu)，具有下述核苷酸序列特征中的一种或二种以上：1)序列表中SEQIDNO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；2)编码序列表中SEQIDNO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；3)与SEQIDNO.1限定的脱氧核糖核酸(DNA)序列的同源性达到80％及以上，且能编码降解葡聚糖的蛋白质的脱氧核糖核酸(DNA)序列；4)对序列表中SEQIDNO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个或几个核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有内切β-1,4-葡聚糖酶活性的核苷酸序列。本专利技术还提供了内切β-1,4-葡聚糖酶Ppglu的氨基酸序列，具有如下特征中的一种或二种以上：1)序列表中的SEQIDNO.2从氨基端开始的第1-374位氨基酸残基序列，其中1-366位为具有内切β-1,4-葡聚糖酶Ppglu活性的氨基酸序列，367-374位为酶切位点及His-Tag的氨基酸序列；2)将序列表中的SEQIDNO.2从氨基端开始的第1-374或1-366位氨基酸残基进行一个或两个以上氨基酸取代、缺失或添加而形成具有内切β-1,4-葡聚糖酶活性不变的氨基酸序列。本专利技术的内切β-1,4-葡聚糖酶Ppglu的氨基酸序列及其核苷酸编码序列也可以根据预测的β-1,4-葡聚糖酶Ppglu的氨基酸序列及其核苷酸编码序列人工合成获得。制备重组酶Ppglu的方法，是将内切β-1,4-葡聚糖酶基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的内切β-1,4-葡聚糖酶。上述内切β-1,4-葡聚糖酶基因，其核苷酸序列具有如下特征中的一种或二种以上：1)具有序列表中SEQIDNO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；2)编码SEQIDNO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；3)对序列表中SEQIDNO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个或两个以上核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有内切β-1,4-葡聚糖酶活性的核苷酸序列；所述的重组表达内切β-1,4-葡聚糖酶Ppglu的表达载体可以是大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体等。用于重组表达内切β-1,4-葡聚糖酶Ppglu的重组菌或转基因细胞系，可以是大肠杆菌宿主细胞(如EscherichiacoliBL21、EscherichiacoliJM109、EscherichiacoliDH5α等)、酵母菌宿主细胞(如Saccharomycescerevisiae、Pichiapastoris、Kluyveromyceslactis等)、枯草杆菌宿主细胞(如BacillussubtilisR25、Bacillussubtilis9920等)、乳酸菌宿主细胞(如LacticacidbacteriaCOCC101等)、放线菌宿主细胞(如Streptomycesspp.等)、丝状真菌宿主细胞(如Trichodermaviride、Trichodermareesei、Aspergillusniger、Aspergillusnidulans等)、昆虫细胞(如Bombyxmori、Antharaeaeucalypti等)或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞CHO、幼小仓鼠肾脏细胞BHK、中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种内切β‑1,4‑葡聚糖酶基因，其核苷酸序列具有如下特征中的一种或二种以上：1)具有序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；2)编码SEQ ID NO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；3)对序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个或两个以上核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有内切β‑1,4‑葡聚糖酶活性的核苷酸序列；4)与SEQ ID NO.1限定的脱氧核糖核酸(DNA)序列的同源性达到80％及以上，且能编码降解葡甘露聚糖的蛋白质的脱氧核糖核酸(DNA)序列。

【技术特征摘要】
1.一种内切β-1,4-葡聚糖酶基因，其核苷酸序列具有如下特征中的一种或二种以上：1)具有序列表中SEQIDNO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；2)编码SEQIDNO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；3)对序列表中SEQIDNO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个或两个以上核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有内切β-1,4-葡聚糖酶活性的核苷酸序列；4)与SEQIDNO.1限定的脱氧核糖核酸(DNA)序列的同源性达到80％及以上，且能编码降解葡甘露聚糖的蛋白质的脱氧核糖核酸(DNA)序列。2.一种权利要求1所述的内切β-1,4-葡聚糖酶基因编码的内切β-1,4-葡聚糖酶，其特征在于：其氨基酸序列具有如下特征中的一种或二种：1)序列表中SEQIDNO.2从氨基端开始的第1-374位氨基酸残基序列；2)对序列表中SEQIDNO.2所示的氨基酸序列进行一个或两个以上氨基酸取代、缺失或添加而形成的具有内切β-1,4-葡聚糖酶活性的氨基酸序列。3.一种权利要求2所述的内切β-1,4-葡聚糖酶的制备方法，其特征在于：将内切β-1,4-葡聚糖酶基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的内切β-1,4-葡聚糖酶；上述内切β-1,4-葡聚糖酶基因，其核苷酸序列具有如下特征中的一种或二种以上：1)具有序列表中SEQIDNO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；2)编码SEQIDNO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；3)对序列表中SEQIDNO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个或两个以上核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有内切β-1,4-葡聚糖酶活性的核苷酸序列；4)所述的重组表达内切β-1,4-葡聚糖酶的表达载体，是指大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹恒，李悝悝，曹海龙，贾晓晨，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁,21