从宏基因组学衍生的纤维素酶制造技术

本发明专利技术涉及来自土壤宏基因组的新型内切葡聚糖酶基因(GH5家族)。更具体而言，本发明专利技术提供了重组质粒和用于表达具有纤维素酶活性的新型基因序列的重组宿主。本发明专利技术的纤维素酶对底物如羧甲基纤维素和大麦‑β‑葡聚糖等中的β‑1,4键具有高比活性。这种新型纤维素酶可具有许多工业应用，例如，食品和饲料工业、洗涤剂、纺织和生物燃料工业等。

Cellulase derived from metagenomics

The present invention relates to a novel endo dextran gene (GH5 family) from the soil metagenomic. More specifically, the present invention provides recombinant plasmids and recombinant hosts for expressing novel gene sequences with cellulase activity. The cellulase of the present invention has high specific activity to the beta 1,4 bonds in substrates such as carboxymethyl cellulose and barley beta glucan. This new cellulase has many industrial applications, such as food and feed industries, detergents, textiles and biofuel industries.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】从宏基因组学衍生的纤维素酶
本专利技术提供了来自土壤宏基因组的新型内切葡聚糖酶基因(GH5家族)。更具体而言，本专利技术提供了重组质粒和用于表达具有纤维素酶活性的新型基因序列的重组宿主。本专利技术的纤维素酶对底物如羧甲基纤维素和大麦-β-葡聚糖等中的β-1,4键具有高比活性。这种新型纤维素酶可具有许多工业应用，例如，食品和饲料工业、洗涤剂、纺织和生物燃料工业等。
技术介绍
一方面需求的不断增加和另一方面化石燃料作为能源的日益枯竭已使得开发替代能源成为必要。使用天然丰富的木质纤维素生物质如农业废弃物、林业废弃物和城市废弃物生产可再生生物燃料将减小社会对化石燃料的依赖。纤维素是木质纤维素的主要组分，已经在很大程度上认识到对新型且高效的纤维素酶的需要(Xing等,2012)。纤维素酶可用于各种各样的工业应用中，如用于造纸工业中以使再生纸脱墨，用于纺织工业以使织物生物抛光和降低棉布的粗糙度，用于洗衣业作为洗涤剂的添加剂，用于食品和饲料工业以改善食物的可消化性，用于酿造工业和农业以实现作物的生物加工，及用于许多其他应用(Bhat,2000；Xing等,2012)。纤维素酶属于酶的糖基水解酶家族，其以协同方式催化纤维素水解。内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)随机切割内部1,4-β-D-葡聚糖键，产生游离的末端。外切葡聚糖酶(EC3.2.1.91和3.2.1.176)逐步作用于还原性和非还原性末端以释放纤维二糖。所产生的二糖然后由β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)消化以释放游离的葡萄糖。这些酶协同作用而导致纤维素水解(Aubert等,1988；Lynd等,2002)。内切葡聚糖酶是引发和导致内部键的广泛水解的主要的酶。根据碳水化合物活性酶数据库(http://www.cazy.org/)(Lombard等,2014)的分类，内切葡聚糖酶属于糖基水解酶家族的14个家族。发现新型纤维素酶的方法之一是通过宏基因组学，宏基因组学是研究微生物多样性和探索具有工业重要性的新型酶的独立于培养的方法(Handelsman,2004；Zengler等,2002)。在各种自然环境中，土壤就其中存在的微生物区系而言是最具多样性和挑战性的(Daniel,2005)。已从土壤宏基因组学发现了许多新型的工业相关酶，如纤维素酶、淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、木聚糖酶等(Daniel,2005；Xing等,2012)。这些酶中的若干在活性、特异性、稳定性等方面具有远优于已知酶的性质。许多纤维素酶已从宏基因组研究中获得，其具有显著的性质，如热稳定性、盐稳定性、pH稳定性。作为实例，已从奶牛的瘤胃液分离出新型宏基因组GH5纤维素酶，其对广泛的底物具有活性(Ko等,2013)。已从甘蔗渣分离出在75℃下具有最佳活性的嗜热GH9内切葡聚糖酶(Kanokratana等,2014)。从叶枝堆肥分离出的宏基因组衍生GH12纤维素酶具有90℃的最适温度(Okano等,2014)。从牛的瘤胃分离出的纤维素酶对作为底物的CMC具有在6-70U/mg范围内的比活性(Ferrer等,2008)。与具有工业相关性的更新型的蛋白质相关的这样的性质对于收获生物质作为可负担且绿色的能源这一充分和成功的目标来说是极其需要的。因此，本专利技术的目的在于提供纤维素酶，其在高温下在宽pH范围内具有活性，对一系列化学和物理条件具有广泛的稳定性和耐受性，在盐和化学品等的存在下具有高活性。附图说明图1：来自质粒文库的阳性克隆的测序揭示了由多个开放阅读框组成的5553个碱基的基因簇。其说明了从宏基因组文库分离出的宏基因组克隆的完整重叠群，示出了不同的开放阅读框(ORF)的存在。图2：该示意图示出了纤维素酶基因和含有该纤维素酶基因的重组载体。其说明了具有N-端6X-His-标签的pET15(b)载体中新基因SEQIDNO:1的克隆的示意。图3：10％SDS凝胶，显示通过Ni-NTA和Superdex-75凝胶过滤层析，纤维素酶基因在大肠杆菌RosettaDE3细胞中的表达和纯化谱。其说明了内切葡聚糖酶的表达和纯化谱。(A)显示表达的和Ni-NTA纯化的内切葡聚糖酶的10％SDS-PAGE。泳道1：蛋白质分子量标记物；泳道2：含有pET15(b)-Cel5R的未诱导大肠杆菌BL21(DE3)Rosetta细胞的粗细胞裂解物；泳道3：经1mMIPTG诱导的含有pET15(b)-Cel5R的大肠杆菌BL21(DE3)Rosetta细胞的粗裂解物；泳道4：离心后来自细胞裂解物的上清液，加载在Ni-NTA珠上；泳道5：流通物(flowthrough)；泳道6：用30mM咪唑洗涤；泳道7：用在还原性条件下流动的300mM咪唑洗脱；染料；泳道8：用在非还原性条件下流动的300mM咪唑洗脱。(B)在Superdex-75(16/60)上的凝胶过滤的10％SDS-PAGE谱。泳道1：Ni+2-NTA纯化蛋白质；泳道2：在还原性条件下的峰-1；泳道3：在还原性条件下的峰-2；泳道4：蛋白分子量标记物；泳道5：在非还原性条件下的峰-1；泳道6：在非还原性条件下的峰-2。(C)Superdex-75凝胶过滤层析谱，以箭头显示峰1和峰2。(D)平板CMC酶谱(0.5％琼脂糖+0.5％CMC)，显示纤维素酶活性条带。图4a：新型纤维素酶多肽的最适温度，在58℃下显示最大活性。其说明了重组内切葡聚糖酶活性的最适温度的确定。在所示温度下于pH6.0(柠檬酸钠缓冲液)下测量活性15分钟。图4b：纤维素酶活性的最适pH曲线，在pH-6柠檬酸钠缓冲液下显示最大活性。其说明了重组内切葡聚糖酶活性的最适pH的确定。酶测定在所示pH下于58℃下进行15分钟。图4c：描绘纤维素酶在不同温度(4、25、50、55℃)下的稳定性的图。其说明了重组内切葡聚糖酶的热稳定性。在于指定温度下将酶温育不同的时间间隔后在最适条件(pH6.0的柠檬酸钠缓冲液、58℃、15分钟)下测量活性。图4d：曲线示出在25℃下温育7天后纤维素酶在不同pH下的稳定性。其说明了重组内切葡聚糖酶的pH稳定性。在经纯化的酶在缓冲液(0.1M柠檬酸钠缓冲液，pH4.0-6.0；0.1MTris-HCl缓冲液，pH7.0-8.0；0.1M甘氨酸-NaOH缓冲液，pH9-10.0)中于25℃下温育168小时后在最适条件(pH6.0的柠檬酸钠缓冲液、58℃、15分钟)下测量活性。图4e：曲线示出当纤维素酶多肽在0.2％CMC底物的存在下温育时与不存在该底物相比在58℃下的稳定性。其说明了在0.2％CMC的存在下与不存在底物相比在58℃下的相对热稳定性。在将酶温育不同的时间间隔后于最适条件(pH6.0的柠檬酸钠缓冲液、58℃、15分钟)下测量活性。图5a：在不同的盐、有机溶剂和洗涤剂的存在下的纤维素酶活性。其说明了在反应中在1mM浓度的各种金属离子、5％浓度的有机溶剂和0.25％的洗涤剂的存在下重组内切葡聚糖酶的相对活性。在最适条件(pH6.0的柠檬酸钠缓冲液、58℃、15分钟)下测量活性。图6a：示出酶在不同盐如NaCl、KCl、LiCl的存在下的活化的图。其示出了不同浓度的离子盐(NaCl、LiCl、KCl)对重组内切葡聚糖酶活性的相对影响。图6b：描绘纤维素酶在不同盐的存在下温育30本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种宏基因组衍生核苷酸序列，其具有选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:31‑45的纤维素酶活性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.11.12 IN 3690/DEL/20151.一种宏基因组衍生核苷酸序列，其具有选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:3和SEQIDNO:31-45的纤维素酶活性。2.根据权利要求1所述的核苷酸序列，其中对应的多肽序列选自SEQIDNO:2、4和5-19。3.一种重组载体，其包含根据权利要求1所述的核苷酸序列，其中所述载体选自大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、丝状真菌表达载体和昆虫或动物细胞载体。4.根据权利要求2所述的多肽，其中所述多肽对选自羧甲基纤维素和大麦-β-葡聚糖的底物中的β-1,4键具有高比活性。5.根据权利要求3所述的表达载体，其中所述表达载体包含与选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:3和SEQIDNO:31-45的多核苷酸序列具有至少85％同一性的多核苷酸。6.根据权利要求3所述的表达载体，其中所述表达载体编码与选自SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18和SEQIDNO:19的多肽序列具有至少85％同一性的多肽。7.一种表达根据权利要求3所述的重组载体的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自大肠杆菌、酵母细胞、枯草芽孢杆菌、黑曲霉和昆虫或动物宿主。8.一种制备具有选自SEQIDNO:2、4和5-19的氨基酸序列的宏基因组...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·加格，V·布拉玛，L·弗玛，G·萨尼，
申请(专利权)人：科学与工业研究委员会，
类型：发明
国别省市：印度,IN