多肽文库制造技术

本发明专利技术涉及在构象上约束于反平行、螺旋‑转角‑螺旋排列的新型多肽文库。本发明专利技术还涉及产生和筛选用于生物学、药学和其它用途的此类文库的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】多肽文库
本专利技术涉及新型多肽文库，其在构象上受约束于反平行、螺旋-转角-螺旋排列。本专利技术还涉及产生和筛选用于生物学、药学和其它用途的此类文库的方法。
技术介绍
肽文库已经成为识别治疗相关分子的有力资源。此外，肽文库也是用于许多其它目的和用于基础研究的相关资源。在治疗上，肽相对于小分子和大生物制剂比如抗体具有某些优势。与小分子相比，肽通常与抗原具有更大的相互作用界面，其包含氢键和范德华力(vanderWaalsforce)。这导致高亲和力结合、对抗原的高特异性和通常的高效力。与抗体相比，肽小得多，因此通常更容易穿透组织。对于抗体疗法来说某些肿瘤难以接近。存在许多噬菌体展示肽文库，包括利用受约束肽的文库。约束肽克服了某些与线性肽相关的缺点，包括由于更高的构象灵活性导致的弱结合亲和力，以及对人体中蛋白水解降解的增加的易感性。(多)肽的天然存在的受约束基序是α-螺旋束。α-螺旋构成最大类的蛋白质二级结构并且在介导蛋白质-蛋白质相互作用中起主要作用。然而，长度为10-30个氨基酸的短合成肽在水中通常不是热力学稳定的螺旋并且仅采取无规结构(Harrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2010Jun29；107(26))。α-螺旋束可以以不同的形式出现，包括两个、四个或甚至多个束。此类束蛋白质中的单个α-螺旋肽可以以平行或反平行排列取向，从而形成卷曲螺旋结构，其中螺旋轴彼此略微偏移地对齐。在此类束中出现的α-螺旋结构通常包含具有由亲水外部、疏水内部和形成螺旋间盐桥相互作用的极性氨基酸残基边界组成的轮廓的七肽(heptad)重复。许多天然存在的蛋白质，如角蛋白、肌球蛋白、表皮素、纤维蛋白原和原肌球蛋白，具有由两条二聚化的α-螺旋肽形成的卷曲螺旋结构。此外，卷曲螺旋结构经常发现于DNA结合蛋白上，其中该基序称为亮氨酸拉链。卷曲螺旋结构域也见于Jun、Fos(O’Shea等，Science.245:646-648(1989))、C/EBP(Landschultz等，Science.240:1759-1764(1988))和例如GCN4结合蛋白(O’Shea等，Science.242:538-542(1989))。发现天然存在的α-螺旋卷曲螺旋结构通常为平行取向，认为这是稳定的构象。已经描述了使此类结构适于设计特定识别分子的方法。WO94/29332描述了含有反平行卷曲螺旋的多肽，其中对所述骨架进行修饰以并入来自天然存在的蛋白质如DNA结合蛋白和细胞因子的螺旋识别序列。美国专利第5,824,483号描述了从头(denovo)设计和化学合成的α-螺旋肽组合文库的构建。α-螺旋肽通过螺旋内的内酰胺桥和任选地通过另外的第二α-螺旋肽从而产生以平行或反平行取向的二聚卷曲螺旋结构而得以稳定。然而，唯一启用的肽文库包含单个24个氨基酸长的α-螺旋多肽链，其通过两个螺旋内的内酰胺桥而得以稳定并且在5个氨基酸位置处多样化。Fujii等(TetrahedronLetters42,3323-3325(2001))描述了基于螺旋-转角-螺旋的文库的更具体的方法。该科学出版物公开了一种从头化学合成的反平行取向的螺旋-转角-螺旋肽文库，其中氨基和羧基末端肽通过基于甘氨酸的接头连接。两条形成螺旋-转角-螺旋的肽中的每一条由14个氨基酸组成，并通过与两个相应螺旋上的亮氨酸残基的疏水相互作用而稳定。与本公开内容的文库相比，仅羧基末端螺旋肽在3个溶剂暴露位置用5个天然存在的氨基酸残基的混合物多样化。利用肽文库的互补方法是在丝状噬菌体上展示此类文库。该方法允许制备大至1010个独特肽成员的文库，比可以合成制备的文库大许多个数量级。噬菌体展示的反平行取向的螺旋-转角-螺旋肽文库由Fujii和Coworkers描述于2008年(Biochemistry,47,6745-6751(2008))。与上述文库相比，羧基末端螺旋肽在5个溶剂暴露区域随机化，产生理论文库大小为3.2×106。该文库展示在丝状噬菌体的主要外壳蛋白VIII上，其中甘氨酸/丝氨酸接头与可检测标签结合。螺旋-转角-螺旋肽文库产生“微抗体”的特定用途已经由Fujii等进一步描述于2011年(DrugDeliverySystem,26-6,2011,p.593-603)、2009年(YakugakuZasshi,129(11),1303-1309,2009)和2013年(CurrentProtocolsinChemicalBiology,vol.5(3),171-194,2013)。由Fujii和Coworkers描述的两个文库的共同结构特征是丙氨酸在两条α-螺旋肽的溶剂暴露位置的主要使用。已知一段丙氨酸(聚丙氨酸)有助于形成α-螺旋结构，但它们也可能在水溶液中显示低溶解度，因此易于聚集。更重要的是，由Fujii和Coworkers描述的文库仅通过使溶剂暴露的丙氨酸位置多样化而在羧基末端α-螺旋肽内多样化。在这种情况下，认为非多样化的氨基末端肽保留其α-螺旋结构并稳定分子的螺旋-转角-螺旋结构。然而，由Fujii提供的羧基末端α-螺旋肽的随机化仍导致文库成员具有不期望的多个无规样构象，这需要特定的纯化过程以富集正确折叠的螺旋-转角-螺旋结构(Fujii等(TetrahedronLetters42,3323-3325(2001))。使两条α-螺旋肽中的仅一条多样化的主要缺点在于，事实上该方法显著限制可实现的文库大小并且显著缩小文库多肽与其所结合的目标靶分子之间的相互作用界面，导致特异性和亲和力降低。基于上述方法的局限性，仍然存在开发改进的相当大的大小的螺旋-转角-螺旋多肽文库的未满足的需求。本公开内容的文库在多个方面与Fujii公开的文库不同。本公开内容的文库的设计基于考虑到统计、结构和合理因素的组合方法。这首先包括分析和使用在天然存在的α-螺旋结构中给定位置处发现的最丰富的氨基酸残基。考虑此类氨基酸具有有利的生物物理性质，包括低免疫原性、对抗温度和化学变性的耐性、对pH变化的相对不敏感性、血清稳定性和对抗蛋白酶的蛋白水解降解的耐性。其次，本公开内容的螺旋-转角-螺旋文库内的可变位置存在于氨基和羧基末端α-螺旋肽两者上，并以相同的相对平行取向展示。这两个特征使得能够在螺旋-转角-螺旋分子的整个长度上形成宽且平的相互作用界面。扩大的相互作用界面对于与目标靶抗原的最佳蛋白质-蛋白质相互作用是至关重要的，导致改善的特异性和亲和力，这两者是治疗性分子开发的关键方面。此外，为了防止由于在两条α-螺旋肽中引入大量可变位置引起的螺旋-转角-螺旋骨架的潜在不稳定性，促进螺旋形成和使螺旋-转角-螺旋结构稳定的另外的结构考量也纳入考虑以在每个不变位置选择最合适的氨基酸残基。对这些氨基酸残基进行选择以通过螺旋间和螺旋内静电相互作用和螺旋间氢键来使分子结构稳定。总之，本公开内容的文库通过使多样化位置的数量最大化而不损害稳定的α-螺旋结构，克服了Fujii和Coworkers公开的螺旋-转角-螺旋文库的限制，导致所得多肽的更高效的开发以及患者中各治疗剂的安全性和有效性的增加。
技术实现思路
本公开内容公开了螺旋-转角-螺旋(HTH)多肽文库，其特征在于特别大的文库大小。多肽能够从该文库中分离，其以本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多肽文库，其中所述文库的每个成员包含式Helix‑1‑Li‑Helix‑2的螺旋‑转角‑螺旋骨架结构，其中Helix‑1和Helix‑2包含第一α‑螺旋肽和第二α‑螺旋肽，其中各个所述α‑螺旋肽包含氨基酸序列X1‑X2‑Hy‑Var1‑X3‑Hy‑Var1‑Var2‑X4‑Hy‑Var1‑X5‑Hy‑Var1‑Var3(SEQ ID NO:1)，其中，X1是D、T、N、S或P，X2是E、P、Q、W或D，X3是M、A、I、Q或R，X4是A、L、R、M、K或E，X5是M、L、A、W、F或K，Hy是具有表现出疏水性大于0.62的侧链的任何氨基酸残基，并且Var1、Var2和Var3是不包括G、P和C的天然存在的氨基酸的混合物，Li是接头，并且所述第一α‑螺旋肽和所述第二α‑螺旋肽形成反平行的卷曲螺旋结构。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.03.04 EP 16158782.91.一种多肽文库，其中所述文库的每个成员包含式Helix-1-Li-Helix-2的螺旋-转角-螺旋骨架结构，其中Helix-1和Helix-2包含第一α-螺旋肽和第二α-螺旋肽，其中各个所述α-螺旋肽包含氨基酸序列X1-X2-Hy-Var1-X3-Hy-Var1-Var2-X4-Hy-Var1-X5-Hy-Var1-Var3(SEQIDNO:1)，其中，X1是D、T、N、S或P，X2是E、P、Q、W或D，X3是M、A、I、Q或R，X4是A、L、R、M、K或E，X5是M、L、A、W、F或K，Hy是具有表现出疏水性大于0.62的侧链的任何氨基酸残基，并且Var1、Var2和Var3是不包括G、P和C的天然存在的氨基酸的混合物，Li是接头，并且所述第一α-螺旋肽和所述第二α-螺旋肽形成反平行的卷曲螺旋结构。2.根据权利要求1所述的文库，其中所述接头Li包含1-30个氨基酸残基(SEQIDNO:2)。3.根据前述权利要求中任一项所述的文库(SEQIDNO:3)，其中X1是D，X2是E，X3在Helix-1中是Q并且在Helix-2中是A，X4在Helix-1中是E并且在Helix-2中是K，并且X5在Helix-1中是K并且在Helix-2中是M。4.根据前述权利要求中任一项所述的文库，其中Hy是L、V或I...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·米勒，A·布特曼，J·普拉斯勒，M·莫斯梅尔，
申请(专利权)人：莫佛塞斯公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE