高效提取植物基因组DNA的无毒提取液组合GNR.1及提取方法技术

本发明专利技术公开了一种高效提取植物基因组DNA的无毒提取液组合GNR.1及提取方法，属于生物技术领域。发明专利技术内容具体包括：利用含PEG8000的SDS提取缓冲液裂解植物细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸，在加入乙酸钾去除大部分蛋白质和多糖后，采用PEG8000/高盐溶液和乙醇/高盐溶液连续两次沉淀DNA，以去除多糖类、多酚类等杂质，得到大量高纯度的DNA。采用本方法可从多种植物的幼叶或成熟叶片中提取出大量高纯度的基因组DNA，对操作者无毒，环境污染小，成本低，时间短，可广泛应用于植物的DNA提取。

Highly effective extraction of GNR.1 from plant genomic DNA and extraction method

The invention discloses a non-toxic extract combination GNR.1 for efficiently extracting plant genomic DNA and an extraction method thereof, belonging to the field of biotechnology. The invention includes: using the SDS extracting buffer containing PEG8000 to lyse plant cells, making chromosome segregation, protein denaturation, and releasing nucleic acid, adding potassium acetate to remove most of the protein and polysaccharide, using PEG8000 / high salt solution and ethanol / high salt solution to precipitate DNA twice in succession to remove polysaccharides and polyphenols. A large number of high purity DNA can be obtained. A large amount of genomic DNA with high purity can be extracted from the young or mature leaves of many plants by this method, which is nontoxic to operators, less environmental pollution, low cost and short time. It can be widely used in plant DNA extraction.

【技术实现步骤摘要】
高效提取植物基因组DNA的无毒提取液组合GNR.1及提取方法
本专利技术属于生物
，涉及植物DNA的提取方法，具体涉及一种高效提取植物基因组DNA的无毒提取液组合GNR.1及提取方法。
技术介绍
分离出符合研究目标和要求的DNA是开展现代分子生物学研究的第一步。与动物相比，植物细胞除有细胞壁外，不仅含有多糖、多酚等多种不易与DNA分离的次生代谢物，而且用于DNA提取的组织(如叶片)的成熟度也常常难以控制，因此，植物DNA提取的成功率低，难度较大。依据提取缓冲液中选用的表面活性剂和最后纯化、回收DNA方法的不同，从植物组织中分离DNA的方法通常有4种(见表1)，即：常规CTAB法、常规SDS法、SDS吸附法和CTAB吸附法。通常，采用前两种方法可从几乎所有植物较为幼嫩的叶片中提取到满足实验要求的足量DNA且费用低廉。其中，常规CTAB法在细胞膜裂解和除多糖方面的表现要优于常规SDS法，因而其适用性更加广泛，使用频率也最高。但这两种方法也存在不足，一是提取时间长，二是在绝大多数情况下要使用剧毒的氯仿/苯酚进行抽提。各种试剂盒多采用后两种方法，但费用远高于前两种方法。相比较而言，SDS——吸附法的提取时间较短，且无有机抽提，但费用高昂、DNA产量低，适用范围较小(内容来源于文献ClarkMS.PlantMolecularbiology-Alaboratorymanual[M].CopyrightSpringer-Verlag,BerlinHeidelberg,1997,3-11.和TanakaJ,IdekaS.RapidandefficientDNAextractionmethodfromvariousplantspeciesusingdiatomaceousearthandspinfilter[J].BreedSci,2002,52:151-155.和MurrayMG,ThompsonWE.RapidisolationofhighmolecularweightDNA[J].NucleicAcidsRes,1980,8:4221-4235.和DellaportaS,WoodJ,HicksJ.AplantDNAminipreparationVer.II[J].PlantMolBioRep,1983(1):19-21.DoyleJJ,DoyleJL.IsolationofplantDNAfromfreshtissue[J].Focus,1990,12:12-15.以及孙璐宏，鲁周，民张丽.植物基因组DNA提取与纯化研究进展[J].西北林学院学报，2010，25(6)：102-106.等文献)表1植物DNA提取方法的比较在常规的植物DNA提取方法中，氯仿、苯酚被广泛用于抽提以除去蛋白质和多糖，β-巯基乙醇被用于防止多酚类物质的氧化，异丙醇用于沉淀DNA。其中：氯仿极易挥发，经呼吸系统或皮肤吸收入人体后可引起中毒，且有致癌的可能，虽不可燃但为制毒用化合物，因此其生产、销售及使用受到严格的管控；β-巯基乙醇易挥发，可燃，对人类表现为高毒；异丙醇有一定挥发性，对人体表现为低毒，但在常温下可引火燃烧，其蒸汽与空气的混合易形成爆炸混合物；苯酚虽无挥发性但可燃，对人体则表现为高毒。总之，上述有机试剂不仅对人体有害，而且对环境有严重危害，可对水体和大气造成污染。近年来，我国对安全问题和环境问题越来越重视，因此，无有机抽提乃至无毒日渐成为DNA提取方法的重要发展方向之一。Dellaporta等(内容来源于文章DellaportaS,WoodJ,HicksJ.AplantDNAminipreparationVer.II[J].PlantMolBioRep,1983(1):19-21.DoyleJJ,DoyleJL.IsolationofplantDNAfromfreshtissue[J].Focus,1990,12:12-15)以及Edwards等(内容来源于文章EdwardsK,JohnstoneC,ThompsonC.AsimpleandrapidmethodforthepreparationofplantgenomicDNAforPCRanalysis[J].NucleicAcidsRes,1991,19:1349.)先后专利技术了两种无有机抽提的SDS法。但这两种方法及其衍生方法均与常规SDS法一样，裂解细胞膜和除多糖的能力较差，产量低，因而适用范围狭窄，实际应用很少；同时，这些方法均使用了有毒的β-巯基乙醇和异丙醇。对这两种方法进行改进，克服其缺点，进而开发出无毒、高效、适用性广、费用低的植物DNA提取方法，是解决植物DNA提取过程中存在问题的途径之一。目前，此类提取基因组DNA的方法及应用还未有报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的不足，提供一种高效提取植物基因组DNA的无毒提取液组合GNR.1及提取方法。采用本专利技术及其提取方法可从多种植物的幼叶或成熟叶片中提取出大量高纯度的基因组DNA，对操作者无毒，环境污染小，成本低，时间短，可广泛应用于植物的DNA提取。本专利技术提供一种高效提取植物基因组DNA的无毒提取液组合GNR.1，组成如下：GNR.1A：2.2-3.3％PEG8000，0.54MNaCl，0.11MTris-HCl，0.054MEDTA，0.11-0.33％Vc(临用前加入)，余量为双蒸水；GNR.1D溶液组成为：18-20％PEG8000，3.5-3.8MNaCl，余量为双蒸水；GNR.1E溶液组成为：20mMTris-HCl，2mMEDTA，2.5MNaCl，余量为双蒸水；还包括：20％SDS，使用时单独加入；5M乙酸钾溶液，使用时单独加入。优选地，所述Tris-HCl的pH为8.0。优选地，所述EDTA的pH为8.0。本专利技术还提供一种基于上述无毒、高效、适应性广的提取液组合GNR.1的提取方法，技术方案概述如下：利用溶液GNR.1A(含有PEG8000以及Vc)与SDS抽提缓冲液在65℃条件下裂解植物细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸；之后向上述体系中加入乙酸钾去除大部分蛋白质和多糖后，采用溶液GNR.1D(PEG8000/高盐溶液)和乙醇/溶液GNR.1E(乙醇/高盐溶液)连续两次沉淀DNA，以去除多糖类、多酚类等杂质，得到大量高纯度的DNA。进一步地，在第二次沉淀DNA之前还可以加入少量RNaseA，去除RNA影响。进一步地，所述提取方法具体步骤如下：(1)向植物叶片细粉中依次加入GNR.1A溶液，摇匀；加入质量浓度为20％SDS，摇匀；65℃保温20min，所述植物叶片细粉、GNR.1A溶液以及20％SDS的添加比例为100-200mg：1000μL：75-85μL；(2)向所述步骤(1)体系中加入三分之一体积的5M乙酸钾，65℃保温1min，轻缓摇匀，4℃或冰浴，静置20min，4℃，20000×g，离心20min；(3)吸取步骤(2)体系的上清液，向上清液中加入二分之一体积的GNR.1D溶液，轻缓摇匀，4℃，静置25min，4℃，5000×g，离心15min，弃上清，吸尽残留液体；(4)向步骤(3)体系中加入180-220μL的0.1×TE溶液，轻缓摇匀至沉淀完全溶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效提取植物基因组DNA的无毒提取液组合GNR.1，其特征在于，组成如下：GNR.1A：2.2‑3.3％PEG8000，0.54M NaCl，0.11M Tris‑HCl，0.054M EDTA，0.11‑0.33％Vc临用前加入，余量为双蒸水；GNR.1D：18‑20％PEG8000，3.5‑3.8M NaCl，余量为双蒸水；GNR.1E：20mM Tris‑HCl，2mM EDTA，2.5M NaCl，余量为双蒸水；还包括：20％SDS，使用时单独加入；5M乙酸钾溶液，使用时单独加入。

【技术特征摘要】
2018.05.31 CN 20181054887151.一种高效提取植物基因组DNA的无毒提取液组合GNR.1，其特征在于，组成如下：GNR.1A：2.2-3.3％PEG8000，0.54MNaCl，0.11MTris-HCl，0.054MEDTA，0.11-0.33％Vc临用前加入，余量为双蒸水；GNR.1D：18-20％PEG8000，3.5-3.8MNaCl，余量为双蒸水；GNR.1E：20mMTris-HCl，2mMEDTA，2.5MNaCl，余量为双蒸水；还包括：20％SDS，使用时单独加入；5M乙酸钾溶液，使用时单独加入。2.如权利要求1所述的一种高效提取植物基因组DNA的无毒提取液组合GNR.1，其特征在于：所述Tris-HCl的pH为8.0。3.如权利要求1所述的一种高效提取植物基因组DNA的无毒提取液组合GNR.1，其特征在于：所述EDTA的pH为8.0。4.权利要求1或2或3所述的无毒提取液组合GNR.1应用于提取植物基因组DNA的用途。5.一种基于权利要求1或2或3所述的无毒提取液组合GNR.1提取植物基因组DNA的方法，其特征在于：利用溶液GNR.1A与SDS抽提缓冲液在65℃条件下裂解植物细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸；之后向上述体系中加入乙酸钾去除大部分蛋白质和多糖后，采用溶液GNR.1D和乙醇/溶液GNR.1E连续两次沉淀DNA，以去除多糖类、多酚类等杂质，得到高纯度的DNA。6.如权利要求4所述的提取植物基因组DNA的方法，其特征在于，在...

【专利技术属性】
技术研发人员：桂枝，高建明，
申请(专利权)人：天津农学院，
类型：发明
国别省市：天津,12