酮酸还原酶、基因、工程菌及在合成手性芳香2-羟酸中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种酮酸还原酶、基因、工程菌及在合成手性芳香2‑羟酸中的应用，所述酮酸还原酶氨基酸序列为SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.10之一所示；本发明专利技术提供一种来源于乳酸明串珠菌的高效酮酸还原酶，其能够催化广谱芳香族2‑酮酸，且以苯乙酮酸为底物的底物装载量由100mM提升至400mM。利用酮酸还原酶、2‑羟酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶建立的单菌双质粒三酶串联氧化还原级联体系，能够催化大多数外消旋芳香2‑羟酸高效去消旋化为手性芳香(R)‑2‑羟酸，收率和e.e.值均大于99％。最终应用于去消旋300mM邻氯扁桃酸制备光学纯(R)‑邻氯扁桃酸，收率高达83.8g/(L·d)。

Keto acid reductase, gene, engineering bacteria and their application in the synthesis of chiral aromatic 2- hydroxy acids

The invention discloses a ketoacid reductase, a gene, an engineering bacterium and an application in the synthesis of chiral aromatic 2_hydroxyl acid, the ketoacid reductase amino acid sequence of which is one of SEQ ID NO.4, SEQ ID NO.8 or SEQ ID NO.10, and provides an efficient ketoacid reductase from Leuconostoc lactate, which can catalyze the synthesis of chiral aromatic 2_hydroxy acid. Broad-spectrum aromatic 2 pyruvic acid, and phenylketone acid as substrate for substrate loading increased from 100mM to 400mM. The series redox cascade system of single bacterial double plasmid triphosphatase constructed by ketoate reductase, 2_hydroxy dehydrogenase and glucose dehydrogenase can catalyze the efficient de-racemization of most racemic aromatic 2_hydroxy acids to chiral aromatic (R)2_hydroxy acids in yield and E.E. Optically pure (R) o-chloromandelic acid was synthesized from o-chloromandelic acid with a yield of 83.8 g / (L d).

【技术实现步骤摘要】
酮酸还原酶、基因、工程菌及在合成手性芳香2-羟酸中的应用(一)
本专利技术涉及一种来源于乳酸明串珠菌(Leuconostoclactis)的酮酸还原酶基因、编码酶、载体、工程菌及在合成手性芳香2-羟酸中的应用。(二)
技术介绍
手性2-羟酸是一类在羧基(-COOH)侧C1位有羟基(-OH)取代的化合物，其分布广泛、性质活跃，是生产药物和精细化学品的重要手性砌块，在化工、医药等领域具有重要的应用价值。其中，比较具有代表性的是结构中含有苯环的一类衍生物，如(R)-扁桃酸是生产半合成青霉素、头孢菌素、抗肿瘤药和减肥药的关键中间体，同时是重要的手性拆分剂；(R)-邻氯扁桃酸是合成抗血栓药(氯吡格雷)的关键手性砌块，具有很高的市场需求和经济效益；(R)-4-氯扁桃酸是第一个商品化的扁桃酰胺类杀菌剂(双炔酰菌胺)的合成前体；(R)-4-羟基扁桃酸可用于生产左旋对羟基苯甘氨酸，进而合成多种广谱抗生素，如羟氨苄青霉素和羟氨苄头孢等。正是由于手性2-羟酸在医药和精细化工领域的重要应用，使得如何获取光学纯的手性2-羟酸成为一直以来的研究热点。传统上，制备光学纯手性2-羟酸的方法主要依赖于化学动力学拆分，即选择合适的手性拆分试剂将外消旋混合物转化为非对映体盐，改变两种构型的物理性质，然后再进行后续的分离提取。然而，该方法存在很多的缺陷，如最大收率仅为50％、光学纯度低、拆分试剂昂贵、反应条件苛刻及污染环境等问题。近些年，生物催化法因其具有较高的立体选择性和催化活性、反应条件温和、环境友好等优势而得到越来越多的研究和开发，用于光学纯手性2-羟酸的高效生产。其中，比较具有代表性的包括酶法拆分、腈水解酶法、不对称还原和氧化还原级联去消旋。①酶法拆分，酶法拆分制备光学纯手性2-羟酸属于动力学拆分，通常是指利用生物酶法选择性降解外消旋2-羟酸中的一种构型而获取另一目标构型。其保留了生物酶反应的优势，但最大的缺点是理论收率仅有50％。另外，还有利用脂肪酶拆分邻氯扁桃酸酯得到单一构型的酯化物，然后通过水解的方法获得光学纯邻氯扁桃酸，但是该方法步骤繁琐，不适用于工业化应用。②腈水解酶法，腈水解酶是一类重要的水解酶，可以催化腈类底物一步转化为相应的羧酸，具有良好的催化特性，因此利用腈水解酶生物催化2-羟基腈制备光学纯手性2-羟酸得到广泛的研究。然而，由于该方法在催化过程中需用到大量剧毒的氢氰酸(HCN)，从而导致在实际应用时存在一定的危险性和操作难度。③不对称还原，利用微生物体内具有立体选择性的还原酶将前手性的2-酮酸不对称还原为光学纯2-羟酸。该法的优点是理论产率高，操作简单等；缺点是反应过程一般需要添加辅酶，辅酶价格昂贵，大大增加生产成本，不利于工业化应用。另外，相对于外消旋化合物，前手性的2-酮酸底物不易获取或价格昂贵，限制了其应用。④氧化还原级联去消旋，利用具有对映体选择性的2-羟酸脱氢酶、酮酸还原酶和葡萄糖脱氢酶级联催化外消旋2-羟酸转化为单一构型产物。该法节约时间，省去中产物的提取或纯化，还有可能降低可逆反应向底物方向进行，因此是最具有价值的手性2-羟酸获取方法。同时，借助多基因共表达技术，可以成功构建三酶共表达体系用于外消旋2-羟酸的高效去消旋化。在应用氧化还原级联去消旋的策略制备光学纯手性2-羟酸时，发现酮酸还原酶的活性限制了整体的催化效率，导致底物装载量和产率相对较低。因此，寻找具有高活性和底物耐受性的酮酸还原酶用于三酶共表达催化体系，对实现外消旋2-羟酸的高效去消旋化具有显著的意义。酮酸还原酶是一类重要的氧化还原酶，能够催化前手性酮酸不对称还原为相应的羟基酸，同时需要NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)或NADPH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)作辅因子参与反应。在生物催化领域，生物酶作为催化剂往往具有特定的催化底物，单一酶通常不会对脂肪族和芳香族化合物同时具有催化活性。本研究中所挖掘的酮酸还原酶属于2-脱氢泛解酸-2-还原酶(2-dehydropantoate2-reductase)，已报道的可催化底物均为脂肪族化合物，但实验中却发现其可以高效地催化众多芳香族2-酮酸转化为手性芳香2-羟酸，这对于实现外消旋芳香2-羟酸的高效去消旋化具有重要的应用价值。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种来源于乳酸明串珠菌(Leuconostoclactis)的高效酮酸还原酶基因、编码酶、载体、工程菌及其在合成手性芳香2-羟酸中的应用。所挖掘的酮酸还原酶能够催化广谱芳香族2-酮酸，且具有较高的底物装载量和催化效率。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种酮酸还原酶，所述酮酸还原酶氨基酸序列为SEQIDNO.4、SEQIDNO.8或SEQIDNO.10之一所示，更优选所述酮酸还原酶氨基酸序列为SEQIDNO.4所示。本专利技术是以来源于肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)的酮酸还原酶LeKAR(氨基酸序列为SEQIDNO.2、核苷酸序列为SEQIDNO.1)为模板，从NCBI数据库中筛选出5种氨基酸序列为SEQIDNO.4、SEQIDNO.6、SEQIDNO.8、SEQIDNO.10或SEQIDNO.12的酮酸还原酶，分别来源于乳酸明串珠菌(Leuconostoclactis)、假肠膜明串珠菌(Leuconostocpseudomesenteroides)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、产酸克雷伯菌(Klebsiellaoxytoca)和肠道沙门氏菌(Salmonellaenterica)，氨基酸序列同源性分别在84％、78％、74％、49％和49％，经验证只有SEQIDNO.4、SEQIDNO.8、SEQIDNO.10的酮酸还原酶具有催化活性。任何对SEQIDNO.4、SEQIDNO.8、SEQIDNO.10所示氨基酸序列进行一个或多个氨基酸的缺失、插入或替换处理获得的多肽片段或其变体，只要其与该氨基酸序列具有95％以上同源性，均属于本专利技术的保护范围。本专利技术还提供一种所述酮酸还原酶的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO.3、SEQIDNO.7、SEQIDNO.9之一所示。任何对SEQIDNO.3、SEQIDNO.7、SEQIDNO.9所示核苷酸序列进行一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入处理获得的核苷酸序列，只要其与该核苷酸序列具有90％以上的同源性，均属于本专利技术的保护范围。本专利技术还涉及所述酮酸还原酶的编码基因构建的重组载体及重组基因工程菌，所述重组基因工程菌为下列之一：(1)将酮酸还原酶编码基因导入宿主菌获得的；(2)将酮酸还原酶编码基因、2-羟酸脱氢酶编码基因和葡萄糖脱氢酶编码基因导入宿主菌获得的。此外，本专利技术还提供一种所述酮酸还原酶在催化合成手性芳香2-羟酸中的应用。应用方法一：当重组基因工程菌是将酮酸还原酶编码基因导入宿主菌获得时，所述的应用方法为：以含酮酸还原酶编码基因的工程菌发酵培养获得的湿菌体经超声破碎后的酮酸还原酶上清液和含葡萄糖脱氢酶编码基因(核苷酸序列为SEQIDNO.15所示)的工程发酵培养获得的湿菌体经超声破碎后的葡萄糖脱氢酶上清液为催化剂，以苯乙酮酸为底物，以NAD+为辅酶，以葡萄糖为辅助底物，以100mM、pH7.0的KH2PO4-K2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种酮酸还原酶，其特征在于所述酮酸还原酶氨基酸序列为SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.10之一所示。

【技术特征摘要】
1.一种酮酸还原酶，其特征在于所述酮酸还原酶氨基酸序列为SEQIDNO.4、SEQIDNO.8或SEQIDNO.10之一所示。2.一种权利要求1所述酮酸还原酶的编码基因，其特征在于所述编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO.3、SEQIDNO.7或SEQIDNO.9之一所示。3.一种权利要求2所述酮酸还原酶的编码基因构建的重组基因工程菌，其特征在于所述重组基因工程菌为下列之一：(1)将酮酸还原酶编码基因导入宿主菌获得的；(2)将酮酸还原酶编码基因、2-羟酸脱氢酶编码基因和葡萄糖脱氢酶编码基因导入宿主菌获得的。4.一种权利要求1所述酮酸还原酶在催化合成手性芳香2-羟酸中的应用。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述的应用方法为：以含酮酸还原酶编码基因的工程菌发酵培养获得的湿菌体经超声破碎后的酮酸还原酶上清液和含葡萄糖脱氢酶编码基因的工程发酵培养获得的湿菌体经超声破碎后的葡萄糖脱氢酶上清液为催化剂，以苯乙酮酸为底物，以葡萄糖为辅助底物，以NAD+为辅酶，以100mM、pH7.0的KH2PO4-K2HPO4缓冲液为反应介质，在35℃、700rpm条件下反应，反应完全后，获得含(R)-扁桃酸的反应液；所述酮酸还原酶上清液用量以酮酸还原酶酶活计为800U/mL缓冲液，所述葡萄糖脱氢酶上清液用量以葡萄糖脱氢酶酶活计为800U/mL缓冲液，所述葡萄糖用量以缓冲液体积计为200～800mM，所述底物用量以缓冲液体积计为100～400mM，NAD+用量以缓冲液体积计为0.5mM。6.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述的应用方法为：以含酮酸还原酶、2-羟酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以外消旋芳香2-羟酸为底物，以葡萄糖为辅底物，以pH6.0～8.0的缓冲液为反应介...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛亚平，郑裕国，王闯，柳志强，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33