醇脱氢酶突变体及其在双芳基手性醇合成中的应用制造技术

本发明专利技术公开了醇脱氢酶突变体及其在双芳基手性醇合成中的应用，属于生物工程技术领域。本发明专利技术的醇脱氢酶突变体具有优良的催化活性和立体选择性，可高效催化制备一系列R‑和S‑构型的手性双芳基醇。将本发明专利技术的所述的醇脱氢酶与葡萄糖脱氢酶或甲酸脱氢酶进行偶联，可用于多种抗组胺药物手性双芳基醇中间体的合成。与现有报道相比，本发明专利技术的醇脱氢酶不对称催化还原制备双芳基手性醇的方法具有操作简便、底物浓度高、反应完全、产品纯度高的优势，具有很强的工业应用前景。

Alcohol dehydrogenase mutants and their application in the synthesis of diaryl chiral alcohols

The invention discloses an alcohol dehydrogenase mutant and its application in the synthesis of diaryl chiral alcohols, belonging to the field of bioengineering technology. The alcohol dehydrogenase mutant of the present invention has excellent catalytic activity and stereoselectivity, and can efficiently catalyze the preparation of a series of chiral diaryl alcohols with R and S configurations. The alcohol dehydrogenase of the invention is coupled with glucose dehydrogenase or formic acid dehydrogenase, and can be used for the synthesis of chiral diaryl alcohol intermediates of various antihistamine drugs. Compared with the existing reports, the method for preparing diaryl chiral alcohols by asymmetric catalytic reduction of alcohol dehydrogenase has the advantages of simple operation, high substrate concentration, complete reaction and high product purity, and has a strong industrial application prospect.

【技术实现步骤摘要】
醇脱氢酶突变体及其在双芳基手性醇合成中的应用
本专利技术涉及醇脱氢酶突变体及其在双芳基手性醇合成中的应用，属于生物工程

技术介绍
手性双芳基醇化合物是合成众多药物和精细化学品的关键手性中间体，其中手性(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇(CPMA)是合成抗组胺药物倍他司汀的关键手性中间体。以潜手性(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮(CPMK)为原料，通过化学法不对称还原合成手性CPMA主要由以下五种技术实现：1.在底物浓度为1.0mM条件下，以trans-RuCl2[(R)-xylbinap][(R)-daipen]为催化剂，在压力为40-60psi充氮气条件下室温反应24h，还原获得(S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇((S)-CPMA)，其ee值为60.6％，产率为98％。(C.Y.Chen,etal.,Org.Lett.,2003,5,5039-5042)。2.以(S)-[Ru(BINAP)Cl2]2(NE3)为催化剂，加压，通氢气，还原得到(S)-CPMA)，ee值为99％。(赵志全等,中国医药工业杂志,2006,37,726-727)。3.以CPMK为原料，在底物浓度仅为0.2mM条件下以(S,S)-6-CHOONa为催化剂，在50℃条件下反应24h，还原获得的(R)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇((R)-CPMA)，其ee值为40.8％，产率为90％。(B.G.Wang,Org.Lett.,2017,19,2094-2097)。4.以CPMK为原料，采用三步反应，1)先用三氟甲磺酸酐等进行保护，2)再用催化剂钯配位体及Me-CBS等还原羰基到S构型羟基，3)在三苯基磷钯作用下脱保护，得到(S)-CPMA。(中国专利CN101848893A)。5.以手性BINAL-H为手性还原剂，在底物浓度为400mMCMPK条件下定向合成单一构型CPMA。进行乙酸乙酯-石油醚重结晶后，(R)-CPMA收率88.2％，纯度96.2％，(S)-CPMA收率87.4％，纯度95.7％。(中国专利CN103121966A)。由此可见，上述反应存在贵金属配位体催化剂成本较高、底物浓度低、反应需要高压条件、操作步骤较多、物光学纯度低的问题，不能满足药物对光学纯度的要求，不利于工业化生产。生物催化是指利用酶或者生物有机体(细胞、细胞器、组织等)作为催化剂进行化学转化的过程，作用条件温和，在常温、中性和水等环境中完成，对于手性活性药物成分的合成具有独特的优点。符合“可持续发展”、“绿色化学”、“环境友好制造”等工业发展的目标。与化学合成方法相比，使用醇脱氢酶将潜手性酮中的羰基进行不对称还原的反应具有立体选择性高、反应条件温和等优势，具有重要的经济、社会价值和生态意义。生物不对称还原法主要可通过以下四种技术实现：1.2007年，Truppo等筛选了一系列商品化酮还原酶KRED后，发现虽然有一些酮还原酶对双芳基底物有还原能力，但立体选择性一般，且底物谱较窄，底物中的取代基团对立体选择性的影响较大。仅KRED124可以不对称还原CPMK生成(R)-CPMA，ee值为94％，转化率98％，且需要外加葡萄糖脱氢酶提供辅酶循环。(M.D.Truppo,Org.Lett.,2007,9,335-338)。2.2009年，朱敦明等发现来游于Sporobolomycessalmonicolor的重组羰基还原酶SsCR及其突变体可以立体选择性还原不同双芳基酮底物(8-99％ee)。在葡萄糖脱氢酶的协助下，还原CPMK生成(R)-CPMA，转化率62％，对映选择性为88％(R)。(D.M.Zhu,Org.Lett.,2008,10,525-528)。3.2012年，周婕妤等通过传统富集培养筛选到一株克鲁维酵母Kluyveromycessp.CCTCCM2011385，可催化还原CPMK生成(S)-CPMA(87％ee)。然而活性酶在野生菌中的含量低，最高仅能催化2g/L底物，产物浓度较低，分离成本高，因而不能满足应用的需要。(Y.Ni,ProcessBiochem.,2012,47,1042-1048；中国专利CN102559520A)。4.2013年，李哲等研究了一个来源于毕赤酵母GS115的羰基还原酶PasCR对一系列双芳香基甲酮类化合物的不对称还原，底物浓度为10mM，转化率最高只有50％。(李哲等,生物工程学报,2013,29,68-77)。由此可知，采用生物不对称还原法制备手性CPMA的立体选择性较难达到医药的要求大于95％的对映体过量值，尤其缺乏合成制备(S)-CPMA的还原酶，因此亟需开发高效、高立体选择性的生物酶催化剂。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中的醇脱氢酶立体选择性较低的问题，提供了一系列醇脱氢酶的突变体蛋白质、编码该突变体蛋白质的核酸序列，含有该核酸序列的重组表达载体和重组表达转化体，以及该醇脱氢酶突变体蛋白质或表达该醇脱氢酶突变体蛋白质的重组转化体作为催化剂在不对称还原、制备光学手性双芳基醇中应用。本专利技术的第一个目的是提供一种更高的反应活性和立体选择性的醇脱氢酶突变体。在本专利技术的一种实施方式中，所述醇脱氢酶突变体是将氨基酸序列为SEQIDNO.2所示醇脱氢酶的一个或多个氨基酸位点进行突变。在本专利技术的一种实施方式中，所述醇脱氢酶突变体是将氨基酸序列为SEQIDNo.2醇脱氢酶的第214位谷氨酸、第237位丝氨酸中的一个或两个位点进行突变。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列为SEQIDNO.2所示氨基酸序列的214为谷氨酸替换为缬氨酸(E214V)，命名为M1。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列为SEQIDNO.2所示氨基酸序列的214为谷氨酸替换为酪氨酸(E214Y)，命名为M2。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列为SEQIDNO.2所示氨基酸序列的214为谷氨酸替换为异亮氨酸(E214I)，命名为M3。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列为SEQIDNO.2所示氨基酸序列的214为谷氨酸替换为甘氨酸(E214G)，命名为M4。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列为SEQIDNO.2所示氨基酸序列的214为谷氨酸替换为谷氨酰胺(E214Q)，命名为M5。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列为SEQIDNO.2所示氨基酸序列的214为谷氨酸替换为丝氨酸(E214S)，命名为M6。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列为SEQIDNO.2所示氨基酸序列的214为谷氨酸替换为天冬酰胺(E214N)，命名为M7。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列为SEQIDNO.2所示氨基酸序列的214为谷氨酸替换为精氨酸(E214R)，命名为M8。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQIDNo.2所示醇脱氢酶的第214为谷氨酸替换为缬氨酸，同时将237位点的丝氨酸替换成丙氨酸(E214V/S237A)，命名为M9。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQIDNo.2所示醇脱氢酶的第214为谷氨酸替换为酪氨酸，同时将237位点的丝氨酸替换成丙氨本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种醇脱氢酶的突变体，其特征在于，所述突变体是将氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示醇脱氢酶的一个或多个氨基酸位点进行突变。

【技术特征摘要】
1.一种醇脱氢酶的突变体，其特征在于，所述突变体是将氨基酸序列为SEQIDNO.2所示醇脱氢酶的一个或多个氨基酸位点进行突变。2.根据权利要求1所述突变体，其特征在于，所述突变体是将氨基酸序列为SEQIDNo.2醇脱氢酶的第214位谷氨酸、第237位丝氨酸中的一个或两个位点进行突变。3.根据权利要求1或2所述突变体，其特征在于，所述突变体位以下M1～M16：M1是将氨基酸序列如SEQIDNo.2所示醇脱氢酶的第214为谷氨酸替换为缬氨酸；M2是将氨基酸序列如SEQIDNo.2所示醇脱氢酶的第214为谷氨酸替换为酪氨酸；M3是将氨基酸序列如SEQIDNo.2所示醇脱氢酶的第214为谷氨酸替换为异亮氨酸；M4是将氨基酸序列如SEQIDNo.2所示醇脱氢酶的第214为谷氨酸替换为甘氨酸；M5是将氨基酸序列如SEQIDNo.2所示醇脱氢酶的第214为谷氨酸替换为谷氨酰胺；M6是将氨基酸序列如SEQIDNo.2所示醇脱氢酶的第214为谷氨酸替换为丝氨酸；M7是将氨基酸序列如SEQIDNo.2所示醇脱氢酶的第214为谷氨酸替换为天冬酰胺；M8是将氨基酸序列如SEQIDNo.2所示醇脱氢酶的第214为谷氨酸替换为谷氨酰胺；M9是将氨基酸序列如SEQIDNo.2所示醇脱氢酶的第214为谷氨酸替换为缬氨酸，同时将237位点的丝氨酸替换成丙氨酸；M10是将氨基酸序列如SEQIDNo.2所示醇脱氢酶的第214为谷氨酸替换为酪氨酸，同时将237位点的丝氨酸替换成丙氨酸；M11是将氨基酸序列如SEQIDNo.2所示醇脱氢酶的第214为谷氨酸替换为异亮氨酸，同时将第237位点的丝氨酸替换成丙氨酸；M12是将氨基酸序列如SEQIDNo.2所示醇脱氢酶的第214为谷氨酸替换为甘氨酸，同时将第237位点的丝氨酸替换成半胱氨酸；M13是将氨基酸序列如SEQIDNo.2所示醇脱氢酶的第214为谷氨酸替换为谷氨酰胺，同时将第237位点的丝氨酸替换成半胱氨酸；M14是将氨基酸序列如SEQIDNo.2所示醇脱氢酶的第214为谷氨酸替换为丝氨酸，同时将第237位点的丝氨酸替换成半胱氨酸；M15是将氨基酸序列如SEQID...

【专利技术属性】
技术研发人员：倪晔，王岳，戴威，许国超，周婕妤，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32