本发明专利技术公开了提高比活的葡萄糖氧化酶突变体及其编码基因，涉及基因工程领域。本发明专利技术采用定点突变技术和易错PCR方法将黑曲霉Aspergillus niger GIM 3.452(CICC 2377)的葡萄糖氧化酶(GOD)基因进行定点突变，所述突变位点包括：第10位、第20位、第34位、第70位、第106位、第110位、第167位、第257、第305位、第362位和第517位；本发明专利技术获得的突变体的比活较原始菌株高，能很好的满足食品、医药、饲料以及纺织工业等领域中应用的需求，有着非常广阔的应用前景。
Improved glucose oxidase mutant with specific activity and its coding genes and Application
The invention discloses a glucose oxidase mutant with higher specific activity and a coding gene thereof, and relates to the field of gene engineering. The present invention uses fixed point mutation technique and error prone PCR method to mutate the glucose oxidase (GOD) gene of Aspergillus niger Aspergillus Niger GIM 3.452 (CICC 2377), and the mutation sites include tenth, twentieth, thirty-fourth, seventieth, 106th, 110th, 167th, 257th, 305th, 362nd and 3.452. 517th, the mutants obtained by this invention are higher than those of the original strain, and can meet the needs of food, medicine, feed and textile industry, and have a very broad application prospect.
【技术实现步骤摘要】
提高比活的葡萄糖氧化酶突变体及其编码基因和应用
本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及提高比活的的葡萄糖氧化酶突变体及其编码基因和应用。
技术介绍
葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase，GOD)在有氧条件下能专一性地催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢。由于GOD具有特殊的酶学特性使其广泛应用于食品、饲料、医药等领域。GOD广泛分布于动植物和微生物体内，相对于动植物，微生物具有生长繁殖快、来源广等优势，因此GOD主要来源于微生物。微生物来源的GOD主要以黑曲霉和青霉为主，相对于青霉，黑曲霉产的GOD具有热稳定性好，底物特异性强等优点。野生型黑曲霉GOD比活力低，生产成本高，限制了其产业化应用。CN105002147A公开了表达量提高的突变葡萄糖氧化酶及其编码基因和应用，通过定点突变，使葡萄糖氧化酶的氨基酸序列突变位点为Y76C和Q279K，提高了表达量，且稳定性好。CN101348794A公开了一种高活力葡萄糖氧化酶的编码基因及制备方法和应用，通过在黑曲霉GOD结构基因的1752位和2272位通过重叠PCR引入两处突变，连接于表达载体，提高了突变酶的酶活。
技术实现思路
本专利技术对来源于黑曲霉的葡萄糖氧化酶进行分子改造，通过定点饱和突变技术和易错PCR方法提高了黑曲霉AspergillusnigerGIM3.452(CICC2377)的葡萄糖氧化酶的比活，降低生产成本，为葡萄糖氧化酶的工业化应用奠定基础。黑曲霉AspergillusnigerGIM3.452的葡萄糖氧化酶基因的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，核苷酸序列如下所示：agcaatggcatcgaagccagcctcctgactgaccccaaggaggttgccggccgcactgtcgactacatcatcgctggtggaggtctgactggactcaccactgctgcccgtctgacggagaaccccgatatcactgtgcttgtcatcgaaagtggctcctacgagtctgacagaggtcctatcattgaggacctgaacgcttacggtgacatttttggcagcagtgtggaccacgcctacgagactgtcgagctcgccaccaacaatcagactgcgctgatccgctccggaaatggtctcggtggctctaccctcgtcaacggtggcacctggactcgcccccacaaggcacaagttgactcatgggagaccgtcttcggaaatgagggctggaactgggacagcgtggccgcctactccctccaggctgagcgtgctcgcgcaccaaatgccaaacagattgctgctggccactactttaatgcatcctgccatggtatcaatggtactgtccacgccggaccccgcgataccggtgatgactactcccccatcgtcaaggctctcatgagcgctgtcgaagacaggggcgttcccaccaagaaggacttgggatgcggtgacccccatggtgtgtccatgttccccaacaccttgcacgaagaccaagtgcgctctgatgccgctcgcgaatggctcctccccaactaccagcgtcccaacctgcaagtcctcactggacagtatgttggaaaggtcctgctcagccagaacgctaccacacctcgtgccgttggcgtggaattcggcacccacaagggcaacacccacaacgtctacgctaagcacgaggtcctcctggccgctggatccgctgtctctcccaccatcctcgaatattccggtatcggaatgaagtccattctagagcctcttggaattgacaccgtcgttgacctgcccgttggtctcaaccttcaggaccagaccacctctaccgtccgctcacgcattacctccgccggtgccggacagggacaggccgcttggttcgctaccttcaacgagacctttggcgactacgccgaaaaggctcacgagctgctcaacaccaagctggagcagtgggccgaagaggccgtcgcccgtggcggattccacaacaccaccgctttgctcatccagtacgagaactaccgcgactggatcgtcaaggacaatgtcgcatactcggaactcttcctcgacacggccggagtggccagtttcgatgtgtgggatcttctgcccttcactagaggatacgtacacatcctcgacaaggacccctacctccgccatttcgcatacgaccctcagtactttctcaacgagcttgacctgctcggccaggctgccgccactcagctggcccgcaacatctccaactccggtgccatgcaaacttatttcgctggagagactattcccggtgacaacctcgcgtatgatgccgacttgagcgcctgggttgagtatatcccgtacaacttccgccctaactaccatggtgtgggtacttgctccatgatgccgaaggagatgggcggtgttgtcgacaatgctgcccgtgtgtatggtgtgcagggactgcgagtcatcgatggttctattccccctacgcaaatgtcgtcccatgttatgacggtcttttatgccatggccttgaagattgcggatgccatcttggcggattatgcttccatgcagtga。本专利技术的目的是提供提高比活的葡萄糖氧化酶突变体，由氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的葡萄糖氧化酶突变得到，突变位点包括如下位点中的一个或多个：第10位由T突变为K、第20位由V变为Y、第34位由T突变为V、第70位由D突变为Q、第106位由V突变为I、第110位由T突变为N、第167位由I突变为L、第257由Q突变为K、第305位由M突变为L、第362位由A突变为T和第517位由G突变为A。优选地，氨基酸序列如SEQIDNO.5、SEQIDNO.6或SEQIDNO.7所示。更优选地，氨基酸序列如SEQIDNO.7所示。本专利技术的再一目的是提供提高比活的葡萄糖氧化酶突变体的编码基因，为编码上述葡萄糖氧化酶突变体的基因。优选地，核苷酸序列如SEQIDNO.2、SEQIDNO.3或SEQIDNO.4所示；或为与SEQIDNO.2、SEQIDNO.3或SEQIDNO.4所示序列具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的序列。本专利技术采用定点饱和突变的方法对SEQIDNO.1所示的葡萄糖氧化酶的第20位、第34位、第70位、第106位、第257位和第517位进行分子改造，经过高通量筛选确定了第20位、第34位、第70位、第106位、第257位和第517位这6个位点的最优突变氨基酸，具体包括：第20位由V突变为Y，即V20Y；第34位则是本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.提高比活的葡萄糖氧化酶突变体，其特征在于，由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的葡萄糖氧化酶突变得到，突变位点包括如下位点中的一个或多个：第10位由T突变为K、第20位由V变为Y、第34位由T突变为V、第70位由D突变为Q、第106位由V突变为I、第110位由T突变为N、第167位由I突变为L、第257由Q突变为K、第305位由M突变为L、第362位由A突变为T和第517位由G突变为A。
【技术特征摘要】
1.提高比活的葡萄糖氧化酶突变体，其特征在于，由氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的葡萄糖氧化酶突变得到，突变位点包括如下位点中的一个或多个：第10位由T突变为K、第20位由V变为Y、第34位由T突变为V、第70位由D突变为Q、第106位由V突变为I、第110位由T突变为N、第167位由I突变为L、第257由Q突变为K、第305位由M突变为L、第362位由A突变为T和第517位由G突变为A。2.根据权利要求1所述的提高比活的葡萄糖氧化酶突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDNO.5、SEQIDNO.6或SEQIDNO.7所示。3.根据权利要求2所述的提高比活的葡萄糖氧化酶突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDNO.7所示。4.提高比活的葡萄糖氧化酶突变体基因，其特征在于，编码权利要求1至3中任一项所述的葡萄糖氧化酶突变体的基因。5.根据权利要求4所述的提高比活的葡萄糖氧化酶突变体基因，其特征在于，核苷酸序...
【专利技术属性】
技术研发人员：聂金梅，李阳源，刘金山，唐业，王建荣，
申请(专利权)人：广东溢多利生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44
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