一种酮还原酶及其催化制备(S)-1-(2-氯苯基)乙醇的方法技术

本发明专利技术涉及酶法制备手性醇，属于基因工程技术用于制备医药中间体的领域。本发明专利技术提供一种酮还原酶及其催化制备(S)‑1‑(2‑氯苯基)乙醇的方法。在该方法中邻氯苯乙酮在酮还原酶催化作用下，转化为(S)‑1‑(2‑氯苯基)乙醇。通过特定氨基酸序列的酮还原酶用于催化制备(S)‑1‑(2‑氯苯基)乙醇，实现底物99％以上的转化率，所制备的产物ee值不低于99.5％，且反应的底物浓度最高280g/L,具备工业放大生产的价值。该反应能够使得底物完全、高效的转化成为目标产物，并且所制备的产物分离提纯简单，后处理成本低，整个工艺流程环境友好度高，原子利用率高。

A ketone reductase and its catalytic method for the preparation of (S) -1- (2- chlorophenyl) ethanol

The invention relates to the preparation of chiral alcohols by enzymatic method, which belongs to the field of genetic engineering technology for preparing pharmaceutical intermediates. The invention provides a ketone reductase and a catalytic method for preparing (S) 1 2 (chlorophenyl) ethanol. In this method, o-chloroacetophenone was converted into (S) 1(2_chlorophenyl) Ethanol Catalyzed by ketone reductase. Ketone reductase with specific amino acid sequence was used to catalyze the preparation of (S) 1(2_chlorophenyl) ethanol. The conversion of substrate was more than 99%. The EE value of the prepared product was not less than 99.5%. The substrate concentration of the reaction was the highest 280g/L, which had the value of industrial scale-up production. The reaction can make the substrate completely and efficiently convert into the target product, and the product is simple to separate and purify, low cost of post-treatment, high environmental friendliness of the whole process, high atom utilization.

【技术实现步骤摘要】
一种酮还原酶及其催化制备(S)-1-(2-氯苯基)乙醇的方法
本专利技术涉及一种医药中间体制备方法，尤其涉及一种酮还原酶及其催化制备(S)-1-(2-氯苯基)乙醇的方法。
技术介绍
(S)-1-(2-氯苯基)乙醇英文名称(S)-1-(2-chlorophenyl)ethanol，对应的CAS号：131864-71-6，分子结构式为：该分子中拥有卤代苯基、手性羟基等活性基团，被广泛用作合成医药、农药及其它精细化学品的重要手性砌块。例如葛兰素史克GSK-461364A项目的肿瘤药物分子CAS#929095-18-1；Schwabe公司ADD-137022项目的癫痫药物CAS#112856-44-7；大麻素受体2药物CAS#1438465-84-9分子均以(S)-1-(2-氯苯基)乙醇为关键手性中间体进行制备。各药物分子结构式为：除此之外，(S)-1-(2-氯苯基)乙醇在医药化工领域仍具有广阔的市场需求。目前化学合成领域已开发出多种光学活性手性醇合成的方法，包括动力学拆分和不对称合成。其中，利用前手性羰基化合物通过生物酶催化的不对称还原合成光学活性手性醇的途径，是生产光学活性手性醇的重要方法。文献Tetrahedron:Asymmetry22(2011)345–350报道采用来自C.laurentiia的酶催化制备(S)-1-(2-氯苯基)乙醇，收率约80％，底物浓度最高18g/L。文献P.Vitaleetal./Tetrahedron:Asymmetry24(2013)389–394报道采用KluyveromycesmarxianusCBS6556的酶催化制备(S)-1-(2-氯苯基)乙醇，收率90％，产物ee值为92％，底物浓度为100g/L，反应时间约96h。文献BiotechnologyandBioengineering,Vol.108,No.4,April,2011报道采用全细胞啤酒酵母催化制备(S)-1-(2-氯苯基)乙醇，底物浓度仅15.4g/L。文献TetrahedronLetters57(2016)899–904报道采用KuraishiacapsulateCBS1993的酶催化制备(S)-1-(2-氯苯基)乙醇，底物浓度为7.38g/L。文献BiotechnolLett(2012)34:2083–2086报道采用Chlorellasp.MK201的酶催化制备(S)-1-(2-氯苯基)乙醇，收率约69％，底物浓度最高0.5g/L。文献J.Chem.Soc.,PerkinTrans.1,2000,3205–3211报道采用Geotrichumcandidum的酶催化制备(S)-1-(2-氯苯基)乙醇，底物浓度为4.1g/L。文献Tetrahedron:Asymmetry20(2009)1521–1525报道采用Aspergillusterreus、Rhizopusoryzae的酶催化制备(S)-1-(2-氯苯基)乙醇，转化率为44％～49％，底物浓度为0.47g/L。文献ApplMicrobiolBiotechnol(2012)93:1075–1085报道采用Rhodococcussp.ST-10、Leifsoniasp.S749的酶催化制备(S)-1-(2-氯苯基)乙醇，转化率为1.25％，底物浓度为1.5g/L。文献CatalLett(2016)146:1079–1086报道采用R.mucilaginosaCCTCCM2014255的酶催化制备(S)-1-(2-氯苯基)乙醇，转化率为94.4％，底物浓度为9.24g/L。专利CN102876734采用KluyveromycesthermotoleransCGMCC2.1492的酶催化制备(S)-1-(2-氯苯基)乙醇，底物浓度为154g/L，但此浓度下转化率仅为5％。专利CN103667368采用干面包酵母催化制备(S)-1-(2-氯苯基)乙醇，转化率为88％，底物浓度为6.6g/L。鉴于现有技术中，还原邻氯苯乙酮得到(S)-1-(2-氯苯基)乙醇的生物催化工艺多存在底物浓度低、转化率低、工艺不具备工业生产实用价值的问题，阻碍酶催化制备(S)-1-(2-氯苯基)乙醇的工艺推向工业化生产。因此，目前急需一种新的适于工业化应用的技术，实现高转化率、高底物浓度、低成本制备高光学纯度的(S)-1-(2-氯苯基)乙醇，满足药物研发与生产方面的市场需求。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种酮还原酶及其催化制备(S)-1-(2-氯苯基)乙醇的方法,该方法能够通过高转化率、高光学纯度、高底物浓度的生物催化工艺制备出(S)-1-(2-氯苯基)乙醇。技术方案一种酮还原酶催化制备(S)-1-(2-氯苯基)乙醇的方法，如式III所示，将邻氯苯乙酮在酮还原酶催化作用下，转化为(S)-1-(2-氯苯基)乙醇：式III中所采用的酮还原酶(KRED)的氨基酸序列如(a)或(b)所述：(a)、所述酮还原酶具有如表SEQIDNo.2所记载的氨基酸序列；(b)、所述酮还原酶为将表SEQIDNo.2中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且能催化邻氯苯乙酮转化为(S)-1-(2-氯苯基)乙醇的酮还原酶的序列。进一步，(b)所述的酮还原酶的氨基酸序列与(a)所述酮还原酶的氨基酸序列具备85％以上的同源性，且该氨基酸序列所编码的酮还原酶能催化邻氯苯乙酮转化为(S)-1-(2-氯苯基)乙醇。进一步，(b)所述的酮还原酶的氨基酸序列与(a)所述酮还原酶的氨基酸序列具备90％以上的同源性，优选为具备93％以上的同源性，更优选为具备95％以上的同源性，最优选为具备97.5％以上的同源性。进一步，所述酮还原酶的基因如下(c)或(d)：(c)、基因的核苷酸序列为序列表SEQIDNo.1所示；(d)、与(c)具有N％以上的同源性(N选自85、90、97.5、99)，且能编码催化邻氯苯乙酮转换为(S)-1-(2-氯苯基)乙醇的酮还原酶的基因。一种含有上述基因的重组表达载体、重组菌或转基因细胞系。进一步，上述酮还原酶以酮还原酶酶粉、酮还原酶酶液、含酮还原酶的细胞等形式参与催化反应，用于催化邻氯苯乙酮转化为(S)-1-(2-氯苯基)乙醇。进一步，所述酮还原酶催化邻氯苯乙酮制备(S)-1-(2-氯苯基)乙醇的工艺步骤包括：将邻氯苯乙酮、酮还原酶酶粉或含有该酮还原酶的细胞(本技术方案中所述“含有酮还原酶的细胞”是指本
常见的用于生产发酵的工程细菌，比如酵母菌、大肠杆菌等。)、辅酶配置成水/异丙醇混合溶液，反应得到产物。进一步，所述邻氯苯乙酮浓度为1～280g/L，优选为180～280g/L，更优选为200～280g/L；进一步，所述酮还原酶的酶粉使用质量与含有酮还原酶细胞的使用质量之比为1:4～6。即1质量份数的酮还原酶酶粉催化效率相当于4～6质量份数酮还原酶细胞的催化效率。进一步，所述含有酮还原酶的细胞浓度为20～90g/L，优选为30～70g/L。如果采用酮还原酶酶粉替换酮还原酶细胞，则酮还原酶酶粉的使用浓度为4～20g/L；进一步，所述异丙醇水溶液中，水与异丙醇体积比为1:1～3，优选为1:1.5～2.5；进一步，反应体系中可以加入辅酶促进反应，当采用含酮还原本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种酮还原酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID No.2 所示，或其氨基酸序列与SEQ ID NO.2 所示的氨基酸序列具备97.5% 以上同源性。

【技术特征摘要】
1.一种酮还原酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，或其氨基酸序列与SEQIDNO.2所示的氨基酸序列具备97.5%以上同源性。2.一种酮还原酶催化制备(S)-1-(2-氯苯基)乙醇的方法，其特征在于：邻氯苯乙酮在酮还原酶催化作用下，转化为(S)-1-(2-氯苯基)乙醇，所述酮还原酶的氨基酸序列如（a）或（b）所述：（a）、所述酮还原酶具有如表SEQIDNo.2所记载的氨基酸序列；（b）、所述酮还原酶为将表SEQIDNo.2中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且能催化邻氯苯乙酮转化为(S)-1-(2-氯苯基)乙醇的酮还原酶。3.如权利要求2所述的酮还原酶催化制备(S)-1-(2-氯苯基)乙醇的方法，其特征在于：（b）所述的酮还原酶的氨基酸序列与（a）所述酮还原酶的氨基酸序列具备90%以上的同源性，且能催化邻氯苯乙酮转化为(S)-1-(2-氯苯基)乙醇。4.如权利要求2所述的酮还原酶催化制备(S)-1-(2-氯苯基)乙醇的方法，其特征在于：所述酮还原酶的基因序列如下（c）或（d）所示：（c）、基因的核苷酸序列为序列表SEQIDNo.1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：竺伟，包蕾，胡集铖，
申请(专利权)人：尚科生物医药上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31