本发明专利技术公开了一种EGFR和HER2基因突变检测试剂盒，其包括：EGFR突变检测试剂，其包括EGFR基因外显子18、19、20、21特异性引物及dNTP溶液，所述特异性引物为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；HER2突变检测试剂，其包括HER2基因外显子20特异性引物及dNTP溶液，所述特异性引物为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。本发明专利技术还公开了一种利用EGFR和HER2基因突变检测试剂盒检测EGFR和HER2基因突变的方法，EGFR和HER2基因突变检测试剂盒的应用，该试剂盒用于检测与肺癌及其他癌症相关的EGFR和HER2基因突变。本发明专利技术快速准确、操作简便。
【技术实现步骤摘要】
EGFR和HER2基因突变检测试剂盒、检测方法及其应用
本专利技术涉及一种EGFR和HER2基因突变检测试剂盒、检测方法及其应用，属于基因突变检测
技术介绍
肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。近50年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位。根据各型肺癌的分化程度和形态特征，目前将肺癌分为两大类，即小细胞肺癌和非小细胞肺癌，后者包括鳞癌、腺癌和大细胞癌。其中非小细胞肺癌（non-smallcelllungcancer，NSCLC）占肺癌的85%以上，而且大部分就诊时已属晚期。近年来在NSCLC的治疗上，化疗的地位虽然没有发生根本动摇，但其疗效已达到一个平台，毒性及不良反应也限制了临床应用。靶向治疗因其可靠的疗效且毒性和不良反应轻，已成为最受关注和最有前途的治疗手段之一。目前国内外已经上市的靶向治疗药物针对的主要靶点包括EGFR、HER2、K-Ras、B-Raf、PIK3CA、ALK融合基因和ROS-1融合基因、c-Met、VEGF等。EGFR、HER2都是ErbB家族受体酪氨酸激酶，表达于正常上皮细胞表面，而在一些肿瘤细胞中常过表达，EGFR、HER2的过表达和肿瘤细胞的转移、侵润、预后差相关。其下游的信号转导通路主要有两条：一条是Ras/Raf/MEK/ERK-MAPK通路，而另一条是PI3K/Akt/mTOR通路。当信号传导至细胞核后，引起核内基因转录水平的增加，从而导致细胞增殖、转化。大量研究结果表明，EGFR基因突变状态是EGFR酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）治疗晚期NSCLC最重要的疗效预测因子。突变通常发生于外显子18~21，其中19外显子缺失及21外显子L858R点突变是最常见的对EGFR-TKI治疗敏感的突变（EGFR敏感突变）。在非选择性中国NSCLC患者中，EGFR总突变率约为30%，腺癌患者突变率约为50%，不吸烟腺癌可高达60%~70%，而鳞癌患者仍有约10%的EGFR敏感突变率。在13%~20%的NSCLC患者中，存在HER2的过表达，HER2基因的突变，主要包括外显子20的772、776、778位发生突变，存在于大约1%~4%的NSCLC患者中，研究显示，HER2的突变可能比其过表达与NSCLC的发病机制更加相关，HER2的过表达和EGFR外显子20的T790M位点突变被认为是抵抗EGFR酪氨酸激酶抑制剂（tyrosinekinaseinhibitor，TKI）治疗的潜在机制。目前对于EGFR和HER2基因突变状态的检测主要有实时定量PCR法、Sanger测序法和二代测序。实时定量PCR法操作复杂，针对每种突变必须有相匹配的引物，因此鉴定上述突变需要10对以上的引物才可以完成；而且只能检测已知的突变，如果有未知突变，实时定量PCR法难以给出结果；同时实时定量PCR法的检测仪器和实验试剂价格比较昂贵，总的费用较高。二代测序虽然可以一次读取EGFR和HER2的所有突变，但是二代测序的价格为数千元到万元，数据处理复杂，周期较长，一般患者难以接受，满足临床用药和检测诊断方面的时效性要求。相比之下，Sanger测序法最为经济，操作简单，技术成熟；但是，以往的测序引物和方法并未涵盖最新的突变位点和扩增区域，限制了该方法的应用。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种EGFR和HER2基因突变检测试剂盒、检测方法及其应用，快速准确、操作简便，采用2对引物检测EGFR基因常见的29种突变和HER2基因常见的3种突变，并可以检测其他未知突变，解决了现有技术中进行EGFR和HER2基因突变检测程序繁琐、费用昂贵的问题。为解决上述技术问题，本专利技术提供一种EGFR和HER2基因突变检测试剂盒，其特征是，其包括：EGFR突变检测试剂，其包括EGFR基因外显子18、19、20、21特异性引物及dNTP溶液，所述特异性引物为SEQIDNO：1和SEQIDNO：2；HER2突变检测试剂，其包括HER2基因外显子20特异性引物及dNTP溶液，所述特异性引物为SEQIDNO：3和SEQIDNO：4。进一步地，还包括TaqDNA聚合酶和PCR缓冲液。进一步地，还包括EGFR基因阳性对照标准品和HER2基因阳性对照标准品。本专利技术还提供一种利用EGFR和HER2基因突变检测试剂盒检测EGFR和HER2基因突变的方法，其特征是，包括以下步骤：（1）肺癌肿瘤组织RNA的提取：使用RNA提取试剂盒抽提肺癌肿瘤组织样本的RNA；（2）肺癌肿瘤组织cDNA文库制备：使用反转录试剂盒制备步骤（1）获得的RNA样本的cDNA文库；（3）PCR反应体系、EGFR基因检测质控体系和HER2基因检测质控体系的制备；（4）PCR扩增反应：将步骤（3）的PCR反应体系放入PCR仪，按PCR反应程序进行扩增反应；（5）Sanger测序：使用基因分析仪对步骤（4）的PCR产物进行Sanger测序。进一步地，所述PCR反应体系为：EGFR或HER2突变检测试剂5μlTaqDNA聚合酶1μlPCR缓冲液15μlcDNA4μl。进一步地，所述的EGFR基因检测质控体系为：EGFR突变检测试剂5μlTaqDNA聚合酶1μlPCR缓冲液15μlEGFR基因阳性对照标准品4μl。进一步地，所述的HER2基因检测质控体系为：HER2突变检测试剂5μlTaqDNA聚合酶1μlPCR缓冲液15μlHER2基因阳性对照标准品4μl。进一步地，所述PCR反应程序为：95oC5分钟；95oC15秒，58oC30秒，72oC1分钟，40个循环；72oC5分钟。本专利技术还提供一种EGFR和HER2基因突变检测试剂盒的应用，其特征是，该试剂盒用于检测与肺癌及其他癌症相关的EGFR和HER2基因突变。本专利技术所达到的有益效果：本专利技术快速准确、操作简便，采用2对引物检测EGFR基因常见的29种突变和HER2基因常见的3种突变，并可以检测其他未知突变，解决了现有技术中进行EGFR和HER2基因突变检测程序繁琐、费用昂贵的问题。附图说明图1为正常EGFR基因外显子18至21的位置和DNA序列；图2为正常HER2基因外显子20的位置和DNA序列；图3为本专利技术实施例提供的检测试剂盒的一个EGFRG719A突变检测结果图；图4为本专利技术实施例提供的检测试剂盒的一个EGFRT790M突变检测结果图；图5为本专利技术实施例提供的检测试剂盒的一个HER2G776S突变检测结果图。具体实施方式下面结合附图对本专利技术作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本专利技术的技术方案，而不能以此来限制本专利技术的保护范围。下列实施例中采用的实施条件可以根据制造厂商所建议的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规条件如分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件。实施例1本专利技术涉及一种EGFR和HER2基因突变检测试剂盒，其包含：(1)EGFR突变检测试剂，其包含EGFR基因外显子18、19、20、21特异性引物及dNTP溶液，所述特异性引物为SEQIDNO：1和SEQIDNO：2；(2)HER2突变检测试剂，其包含HER2基因本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.EGFR和HER2基因突变检测试剂盒，其特征是，其包括：EGFR突变检测试剂，其包括EGFR基因外显子18、19、20、21特异性引物及dNTP溶液，所述特异性引物为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；HER2突变检测试剂，其包括HER2基因外显子20特异性引物及dNTP溶液，所述特异性引物为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。
【技术特征摘要】
1.EGFR和HER2基因突变检测试剂盒，其特征是，其包括：EGFR突变检测试剂，其包括EGFR基因外显子18、19、20、21特异性引物及dNTP溶液，所述特异性引物为SEQIDNO：1和SEQIDNO：2；HER2突变检测试剂，其包括HER2基因外显子20特异性引物及dNTP溶液，所述特异性引物为SEQIDNO：3和SEQIDNO：4。2.根据权利要求1所述的EGFR和HER2基因突变检测试剂盒，其特征是，还包括TaqDNA聚合酶和PCR缓冲液。3.根据权利要求1所述的EGFR和HER2基因突变检测试剂盒，其特征是，还包括EGFR基因阳性对照标准品和HER2基因阳性对照标准品。4.利用权利要求1-3中任意一项所述的EGFR和HER2基因突变检测试剂盒检测EGFR和HER2基因突变的方法，其特征是，包括以下步骤：（1）肺癌肿瘤组织RNA的提取：使用RNA提取试剂盒抽提肺癌肿瘤组织样本的RNA；（2）肺癌肿瘤组织cDNA文库制备：使用反转录试剂盒制备步骤（1）获得的RNA样本的cDNA文库；（3）PCR反应体系、EGFR基因检测质控体系和HER2基因检测质控体系的制备；（4）PCR扩增反应：将步骤（3）的PCR反应体系放入PCR仪，按PCR反应程序进行扩增反应；（5）Sanger测序：使用基因分析仪对步骤（4）的PCR产...
【专利技术属性】
技术研发人员：李国平，程龙，袁得天，张鑫，
申请(专利权)人：昆山德诺瑞尔生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。