本发明专利技术公开了一种检测血小板中miR‑34a基因表达量的引物，所述引物为miR‑34a特异性引物，所述特异性引物的反转引物如SEQ ID NO：1所示、正向引物如SEQ ID NO：2所示、反向引物如SEQ ID NO：3所示。本发明专利技术还公开了一种检测血小板中miR‑34a基因表达量的试剂盒、检测方法以及上述引物和试剂盒的应用。所述引物和试剂盒可用于检测与急性心肌梗死有关的miR‑34a基因的表达量。本发明专利技术快速准确、操作简便。
Primers, kits, detection methods and applications for detecting the expression of microRNA-34a in platelets
【技术实现步骤摘要】
检测血小板中miR-34a基因表达量的引物、试剂盒、检测方法及其应用
本专利技术涉及一种检测血小板中miR-34a基因表达量的引物、试剂盒、检测方法及其应用，属于基因表达量检测
技术介绍
随着人民的生活水平的逐渐提高，冠状动脉疾病俨然已经成为严重威胁人们身体健康和生活质量的主要因素。在60岁及以上的老人中，冠状动脉疾病是导致死亡的第一诱因，而且如今冠状动脉疾病的发病人群愈发年轻化。世界卫生组织宣称全球受冠状动脉疾病影响人数在2020年将会达到8200万人。在冠状动脉疾病的众多疾病表型中，急性心肌梗死（简称急性心梗）发病率最高而且后果最严重，每年因急性心梗死亡人数超过700万人。急性心梗的高发病率和高致死率很大程度上是因为对该病的诊断不及时而且缺乏有效特异的诊断指标。急性心肌梗死的主要发病机制是由冠状动脉粥样硬化斑块破裂继发血栓形成，进而阻塞冠状动脉管腔，导致心肌缺血坏死。在冠状动脉粥样硬化发生的早期阶段，动脉壁上由炎症反应激活的血管内皮细胞会吸附血小板，导致血小板在该部位的聚集和激活。激活的血小板会分泌大量促细胞粘附因子和促炎症反应细胞因子，增强该部位的炎症反应进而加速斑块形成。在内皮细胞、免疫细胞和血小板的共同作用下，斑块会逐渐加重形成能引起稳定心绞痛的稳定斑块或者高风险不稳定斑块。当病人遭遇一些急性感染或刺激后，不稳定斑块部位的炎症反应也会相应增加，此时斑块周围的内皮细胞会因炎症反应出现一定程度的凋亡。当斑块组织周围比较薄弱的内皮层中的内皮细胞出现凋亡后，内皮夹层中的斑块组织就会被暴露于血流中，这个过程就是斑块破裂。一旦夹层中的斑块组织被暴露在血流中，血小板就会通过多种受体系统结合到斑块上并被激活。激活的血小板则会向周围环境中释放大量活性物质，从而激活更多的血小板和免疫细胞，并引起血小板在斑块破裂处大量聚集，逐渐形成血栓。由此可见，从冠状动脉粥样硬化斑块形成到斑块破裂引起急性心梗的整个过程中，血小板都发挥了非常关键的作用。因此，研究急性心梗发生前后不同时期的血小板状态的变化对于寻找准确预测和诊断急性心梗的生物标物预防和治疗急性心梗都具有重大的意义。传统检测手段是对血液中心肌肌钙蛋白的含量进行检测，但是实际情况是在急性心梗发病后3-4小时血液中心脏特异性肌钙蛋白才会显著升高。临床上开发了一种高敏感度方法来检测心肌肌钙蛋白，但是其在提高敏感度的同时牺牲了准确度：这种高敏感度的检测方法在非急性心梗病人中也能检测到很高的心肌肌钙蛋白信号。因此迫切需要找到一种能快速准确判断急性心梗甚至是预测急性心梗发病的生物学指标。鉴于血小板中含有非常丰富的miRNA且其基因表达调控主要由miRNA介导，而血小板参与了从动脉粥样硬化斑块形成到板块破裂引起栓塞导致急性心梗的整个过程，我们通过前期的研究发现：在急性心梗病人的血小板细胞内miRNA表达谱会发生剧烈改变，而且这些miRNA不仅会调控血小板自身的基因表达，还会通过外泌体释放到血液循环中被其他细胞吸收来调节靶细胞的基因表达。同时我们通过比较急性心梗病人和健康人的血小板中miRNA表达谱，寻找到表达水平显著改变的miRNA，即miR-34a，并在急性心梗病人血样及小鼠急性心梗模型中进行了验证，实验结果显示miR-34a具有作为急性心梗的诊断生物标志物的能力。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种检测血小板中miR-34a基因表达量的引物、试剂盒、检测方法及其应用，快速准确、操作简便，以解决现有技术中进行急性心肌梗死预判检测程序繁琐、周期长、费用昂贵的问题。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一方面，本专利技术提供了一种检测血小板中miR-34a基因表达量的引物，所述引物为miR-34a特异性引物，所述特异性引物的反转引物如SEQIDNO：1所示、正向引物如SEQIDNO：2所示、反向引物如SEQIDNO：3所示。另一方面，本专利技术提供了一种检测血小板中miR-34a基因表达量的试剂盒，包含上述检测血小板中miR-34a基因表达量的引物。进一步地，所述试剂盒还包括2×SYBRGreen荧光定量预混液，其包含TaqDNA聚合酶、PCR缓冲液、dNTP、SYBRGreen染料、ROX内参染料和ddH2O。进一步地，所述试剂盒还包括内参基因引物，其中所述内参基因为管家基因U6，所述管家基因U6的正向引物如SEQIDNO：4所示，反向引物如SEQIDNO：5所示。另一方面，本专利技术还提供了一种检测血小板中miR-34a基因表达量的方法，包括以下步骤：（1）使用miRNA分离试剂盒抽提急性心肌梗死患者血小板或血小板外泌体样本中的RNA；（2）使用反转录试剂盒制备步骤（1）获得的RNA样本的cDNA文库；（3）以步骤（2）得到的cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增，检测血小板及血小板外泌体样本中miR-34a表达量；其中荧光定量PCR扩增的引物包括miR-34a特异性引物，所述特异性引物的反转引物如SEQIDNO：1所示、正向引物如SEQIDNO：2所示、反向引物如SEQIDNO：3所示。进一步地，所述荧光定量PCR扩增的反应体系为：miR-34a特异性引物2.5μL2×SYBRGreen荧光定量预混液12.5μLcDNA4μLddH2O6μL进一步地，步骤（3）中检测miR-34a表达量以管家基因U6为内参，采用相对定量法，所述管家基因U6的正向引物如SEQIDNO：4所示，反向引物如SEQIDNO：5所示。另一方面，本专利技术还提供了上述检测血小板中miR-34a基因表达量的引物在制备检测或诊断急性心肌梗死试剂中的应用。另一方面，本专利技术还提供了上述检测血小板中miR-34a基因表达量的试剂盒在检测与急性心肌梗死有关的miR-34a基因表达量中的应用。本专利技术所达到的有益技术效果：本专利技术快速准确、操作简便，解决了现有技术中进行急性心肌梗死预判检测程序繁琐、周期长、费用昂贵的问题。附图说明图1为本专利技术实施例提供的检测试剂盒对miR-34a在血小板中表达量的检测结果图；图2为本专利技术实施例提供的检测试剂盒对miR-34a在血浆外泌体中表达量的检测结果图；图3为本专利技术实施例提供的检测试剂盒对miR-34a在血小板外泌体中表达量的检测结果图。具体实施方式下面结合附图对本专利技术作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本专利技术的技术方案，而不能以此来限制本专利技术的保护范围。下列实施例中采用的实施条件可以根据制造厂商所建议的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规条件如分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件。标本与方法通过坐位上的肘前静脉穿刺，规范化收集新鲜人类受试者静脉血样本。全血（20mL）置于含EDTA的试管中，离心（4℃下，1200g，10分钟）。收集上清，离心（4℃下，12000克，10分钟），取血浆。取5mL血浆快速提取RNA。PCR产物相对定量检测：以管家基因U6为内参对目标基因进行归一化处理，采用公式RQ=2-△△CT计算表达量倍数的变化。实施例本专利技术涉及一种检测血小板中miR-34a基因表达量的试剂盒，包含：(1)miR-34a检测试剂，其包含miR-34a特异性引物，所述特异性引物的反转引物如SEQIDNO：1所示，正向引物如SEQIDNO：2本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测血小板中miR‑34a基因表达量的引物，其特征在于，所述引物为miR‑34a特异性引物，所述特异性引物的反转引物如SEQ ID NO：1所示、正向引物如SEQ ID NO：2所示、反向引物如SEQ ID NO：3所示。
【技术特征摘要】
1.一种检测血小板中miR-34a基因表达量的引物，其特征在于，所述引物为miR-34a特异性引物，所述特异性引物的反转引物如SEQIDNO：1所示、正向引物如SEQIDNO：2所示、反向引物如SEQIDNO：3所示。2.一种检测血小板中miR-34a基因表达量的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的引物。3.根据权利要求2所述的检测血小板中miR-34a基因表达量的试剂盒，其特征在于，还包括2×SYBRGreen荧光定量预混液，其包含TaqDNA聚合酶、PCR缓冲液、dNTP、SYBRGreen染料、ROX内参染料和ddH2O。4.根据权利要求2所述的检测血小板中miR-34a基因表达量的试剂盒，其特征在于，还包括内参基因引物，其中所述内参基因为管家基因U6，所述管家基因U6的正向引物如SEQIDNO：4所示，反向引物如SEQIDNO：5所示。5.一种检测血小板中miR-34a基因表达量的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）使用miRNA分离试剂盒抽提急性心肌梗死患者血小板或血小板外泌体样本中的RNA；（2）使用反转录试剂盒制备步骤（1）获得的RNA样本的cDNA文库；...
【专利技术属性】
技术研发人员：张鑫，李国平，
申请(专利权)人：昆山德诺瑞尔生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。