一种诱导羊膜间充质干细胞成脂分化的培养基及诱导方法技术

本发明专利技术公开了一种诱导羊膜间充质干细胞成脂分化的培养基及诱导方法。该培养基包括基础培养基和添加成分，其中，添加成分包括以下终浓度的组分：罗格列酮0.3‑0.6mmol/L、吡格列酮6‑12μmol/L、谷氨酰胺1‑3v/v％、地塞米松10‑20nmol/L、胰岛素100‑200nmol/L和人参皂苷Rg12‑6mg/L。培养方法是采用上述细胞培养基诱导培养羊膜间充质干细胞，获得脂肪细胞。本发明专利技术提供的培养基中，各组分安全无毒、配伍科学合理，协同增效，可促进间充质干细胞向成脂细胞分化，可大大缩短分化时间，提高分化效率。

【技术实现步骤摘要】
一种诱导羊膜间充质干细胞成脂分化的培养基及诱导方法
本专利技术属于干细胞
，具体涉及一种诱导羊膜间充质干细胞成脂分化的培养基及诱导方法。
技术介绍
间充质干细胞是来源于中胚层的多能干细胞，具有高度自我更新能力和多项分化潜能。目前已在多种如羊膜、骨髓、脐带、肌肉组织、脂肪组织、脐血和牙髓等成熟组织中成功分离并培养出间充质干细胞。羊膜是胎盘包裹胎儿面的一层半透明膜，其表面没有神经、血管、肌肉和淋巴等组织，可从中分离出羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞。早在50多年前，科学家和临床医生们就已经认识到羊膜拥有一定的生物学作用。早期羊膜曾被用作覆盖皮肤伤口的敷料，可以抗感染、减轻炎症的发生，并且抑制细胞的免疫反应，还可以刺激血管的生成，这些特点使它在多种疾病的辅助治疗中得到了较为广泛的应用。人胎盘羊膜来源的间充质干细胞(hAMSCs)来自于原条期的胚外中胚层，在一定条件下具有向多个细胞系分化的潜能，向内胚层分化，如肝细胞、胰岛样细胞；向中胚层分化，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞；向外胚层分化，如神经细胞等。人胎盘羊膜来源的间充质干细胞不仅具有干细胞的特征，还有不排斥性及免疫效果，是细胞移植和组织工程的理想种子细胞。脂肪细胞应用于美容修复软组织缺损具有可塑性强，可适应不同缺损形状的优势，人胎盘羊膜来源的间充质干细胞的成脂诱导潜能，可使其成为美容修复软组织缺损的干细胞来源。因此，人胎盘羊膜来源的间充质干细胞的成脂分化是目前再生医学和组织工程领域的研究热点之一，脂肪组织再生技术是重建和修复由老化和病理因素等导致的脂肪组织丢失和损伤的重要技术手段，脂肪细胞作为脂肪再生工程的种子细胞来源，可大大地驱动新生组织的重建。因此，研发一种新型的诱导羊膜间充质干细胞成脂分化的方法，是本领域技术人员亟待解决的技术问题。
技术实现思路
针对现有技术中的上述不足，本专利技术提供了一种诱导羊膜间充质干细胞成脂分化的培养基及诱导方法，其分化效果好，分化周期短。为实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种诱导羊膜间充质干细胞成脂分化的培养基，包括基础培养基和添加成分，其中，添加成分包括以下终浓度的组分：罗格列酮0.3-0.6mmol/L、吡格列酮6-12μmol/L、谷氨酰胺1-3v/v％、地塞米松10-20nmol/L、胰岛素100-200nmol/L和人参皂苷Rg12-6mg/L。进一步地，添加成分包括以下终浓度的组分：罗格列酮0.5mmol/L、吡格列酮10μmol/L、谷氨酰胺2v/v％、地塞米松15nmol/L、胰岛素150nmol/L和人参皂苷Rg15mg/L。进一步地，基础培养基为DMEM-H。进一步地，基础培养基中还包括0.5-1％青霉素和0.5-1％链霉素。采用上述培养基诱导培养羊膜间充质干细胞，所用羊膜间充质干细胞为第三代至第五代羊膜间充质干细胞，接种密度为2-8×104个/mL，诱导培养条件为37℃，5％CO2，培养时间为13-18天。本专利技术提供的诱导羊膜间充质干细胞成脂分化的培养基及诱导方法，具有以下有益效果：本专利技术提供的培养基中，各组分安全无毒、配伍科学合理，协同增效，可促进间充质干细胞向成脂细胞分化，可大大缩短分化时间，提高分化效率。具体实施方式实施例1一种诱导羊膜间充质干细胞成脂分化的培养基，包括基础培养基和添加成分，其中，基础培养基为含有0.5％青霉素和0.5％链霉素的DMEM-H，添加成分包括以下终浓度的组分：罗格列酮0.3mmol/L、吡格列酮6μmol/L、谷氨酰胺1v/v％、地塞米松10nmol/L、胰岛素100nmol/L和人参皂苷Rg12mg/L。实施例2一种诱导羊膜间充质干细胞成脂分化的培养基，包括基础培养基和添加成分，其中，基础培养基为含有0.5％青霉素和0.5％链霉素的DMEM-H，添加成分包括以下终浓度的组分：罗格列酮0.6mmol/L、吡格列酮12μmol/L、谷氨酰胺3v/v％、地塞米松20nmol/L、胰岛素200nmol/L和人参皂苷Rg16mg/L。实施例3一种诱导羊膜间充质干细胞成脂分化的培养基，包括基础培养基和添加成分，其中，基础培养基为含有0.5％青霉素和0.5％链霉素的DMEM-H，添加成分包括以下终浓度的组分：罗格列酮0.4mmol/L、吡格列酮8μmol/L、谷氨酰胺1.5v/v％、地塞米松13nmol/L、胰岛素130nmol/L和人参皂苷Rg13mg/L。实施例4一种诱导羊膜间充质干细胞成脂分化的培养基，包括基础培养基和添加成分，其中，基础培养基为含有0.5％青霉素和0.5％链霉素的DMEM-H，添加成分包括以下终浓度的组分：罗格列酮0.5mmol/L、吡格列酮10μmol/L、谷氨酰胺2.5v/v％、地塞米松18nmol/L、胰岛素180nmol/L和人参皂苷Rg14mg/L。实施例5一种诱导羊膜间充质干细胞成脂分化的培养基，包括基础培养基和添加成分，其中，基础培养基为含有0.5％青霉素和0.5％链霉素的DMEM-H，添加成分包括以下终浓度的组分：罗格列酮0.5mmol/L、吡格列酮10μmol/L、谷氨酰胺2v/v％、地塞米松15nmol/L、胰岛素150nmol/L和人参皂苷Rg15mg/L。对比例1对比例1与实施例5相比，不同之处在于，不含人参皂苷。对比例2对比例2与实施例5相比，不同之处在于，不含地塞米松。对比例3对比例3与实施例5相比，不同之处在于，不含地塞米松和人参皂苷。试验例1、hAMSCs分离培养(1)在无菌条件下获取38-40周正常剖宫产胎盘，确认其来源无肝炎、梅毒、HIV等传染性疾病，并与产妇及其家属签署了知情同意书。(2)采用手术剪把整个羊膜从胎盘上剪下来，然后放入15cm玻璃培养皿中，去除血块和损伤较严重的部位，再用PBS缓冲液漂洗3-4次。(3)用手术剪将羊膜剪成30-50cm2大小的组织碎片，分装到50mL的离心管中，其中组织碎片的体积为10-15mL。(4)加入组织碎片三倍体积的0.25％胰蛋白酶，置于37℃、200r/min恒温振荡器中消化30min，每隔10min取出，剧烈摇晃。(5)消化结束后，用镊子将消化好的组织块转移至装有PBS缓冲液的250mL储液瓶中，加入PBS溶液，盖紧盖子后，剧烈震荡，弃上清，如此重复漂洗2-3次。(6)将步骤(5)漂洗后的组织碎片采用手术剪将羊膜剪成10-30cm2大小的组织。(7)向步骤(6)所得组织碎片中加入20mL的0.5％I型胶原酶，补加DMEM/F12培养基至终体积为100mL，置于37℃、200r/min恒温振荡器中消化，每隔10min取出用手剧烈摇晃，直到组织块完全消化。(8)消化完成后，消化好的组织液分装至50mL离心管中，每管20-25mL，加入等体积的PBS缓冲液，2000r/min离心5min。弃上清后加入10mLPBS缓冲液重悬细胞沉淀，用200μm滤膜过滤，取滤液2000r/min离心5min，弃上清，然后加入5-10mL含FBS的DMEM/F12完全培养基重悬细胞，获得羊膜间充质干细胞悬液。(9)对细胞悬液进行细胞计数，根据计数结果调整细胞悬液密度到1.0-1.5×105个/mL接种于培养皿中，于5％CO2培养箱37℃培养。(10)细胞接种4本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种诱导羊膜间充质干细胞成脂分化的培养基，其特征在于，包括基础培养基和添加成分，其中，添加成分包括以下终浓度的组分：罗格列酮0.3‑0.6mmol/L、吡格列酮6‑12μmol/L、谷氨酰胺1‑3v/v％、地塞米松10‑20nmol/L、胰岛素100‑200nmol/L和人参皂苷Rg12‑6mg/L。

【技术特征摘要】
1.一种诱导羊膜间充质干细胞成脂分化的培养基，其特征在于，包括基础培养基和添加成分，其中，添加成分包括以下终浓度的组分：罗格列酮0.3-0.6mmol/L、吡格列酮6-12μmol/L、谷氨酰胺1-3v/v％、地塞米松10-20nmol/L、胰岛素100-200nmol/L和人参皂苷Rg12-6mg/L。2.根据权利要求1所述的诱导羊膜间充质干细胞成脂分化的培养基，其特征在于，所述添加成分包括以下终浓度的组分：罗格列酮0.5mmol/L、吡格列酮10μmol/L、谷氨酰胺2v/v％、地塞米松15nmol/L、胰岛素150nmol/L和人参皂苷Rg15mg/L。3.根据权利要求1或2所述的诱导...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊华强，宋彩霞，孙静，秦连荣，熊惠芳，
申请(专利权)人：重庆斯德姆生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆,50