一株草鱼肌肉组织细胞系及应用制造技术

本发明专利技术公开了一株草鱼肌肉细胞株及其制备方法，该细胞株的保藏号是：CCTCC NO.C201833；其制备步骤是：1)取草鱼肌肉组织，灭菌处理，剪成碎末接种中，培养箱中干贴，加入细胞培养液培养，第6天细胞开始迁出；用PBS清洗，加入含EDTA的胰酶消化细胞，待细胞变圆后，用培养液洗脱，离心收集细胞培养，每2天更换培养液，至细胞长成80％‑90％汇合的原代肌肉细胞；2)原代草鱼肌肉细胞铺满单层后，除去培养液，PBS清洗，以含EDTA的胰酶消化细胞，待细胞脱壁，吸去消化液，加入细胞培养液分散、悬起细胞，传代培养。本发明专利技术的制备方法简单，制备出来的细胞株可很好地应用于草鱼呼肠孤病毒的分离、繁殖及草鱼出血病疫苗的研制。

A cell line of grass carp muscle tissue and its application

The invention discloses a grass carp muscle cell line and its preparation method, the preservation number of the cell line is: CCTCC NO.C201833; the preparation steps are: 1) take the muscle tissue of grass carp, sterilize, cut into the inoculation of the broken end, dry up in the incubator, add cell culture medium, and start to move out of the cell in sixth days; clean with PBS, add After the cells became EDTA, after the cells became round, the cells were eluted with culture fluid and centrifuged to collect cell culture. Every 2 days, the culture medium was replaced, and the cells grew into 80% primary muscle cells of 90% confluence. 2) after the primary grass carp muscle cells were covered with monolayer, the culture solution was removed, and PBS was cleaned with EDTA trypsin digested cells, waiting for the cells to be digested. The cells were removed from the wall, sucked out the digestive juice, and the cell culture medium was dispersed and suspended, and the cells were passaged. The preparation method of the invention is simple, and the prepared cell line can be well applied to the isolation and reproduction of the grass carp reovirus and the development of the grass carp hemorrhagic vaccine.

【技术实现步骤摘要】
一株草鱼肌肉组织细胞系及应用
本专利技术涉及细胞学
，特别涉及一株草鱼肌肉组织细胞系及其应用。
技术介绍
草鱼(Ctenopharyngodonidellus)属鲤形目鲤科雅罗鱼亚科草鱼属，是中国淡水养鱼的主要品种，其产量约占淡水养殖总产量的20％。由于现有的草鱼养殖常以高密度放养、大量施肥、投饵的模式获取高产，使得养殖水体恶化严重，诱使鱼体病害频发，尤其以呼肠孤病毒(GCRV)引起的病毒性出血病最甚，直接影响草鱼养殖的经济效益。目前针对病毒性出血病的防治除了免疫“草鱼出血病活疫苗(GCHV-892株)”，并无其它有效手段，且该疫苗对不同基因型呼肠孤病毒的作用有限。所以，对研究草鱼出血病病毒及其感染途径、感染机理以及不同基因型病毒疫苗的研制等极具意义。细胞是病毒研究及新型疫苗研制最为重要的材料和工具，建立对GCRV敏感的、可稳定传代的细胞系，是进行草鱼出血病病毒的分离与鉴定、研究其致病机理、疫苗制备和免疫预防技术的重要基础。自从1962年第一个硬骨鱼类细胞系—虹鳟鱼性腺细胞系RTG-2成功构建以来，已有近300株不同的鱼类细胞系相继建立，组织来源包括胚胎及成鱼的肾脏、心脏、脾脏、鳍条、性腺、脑、肌肉、皮肤等。迄今为止，由草鱼组织建立的细胞系已报道的有：草鱼肾脏细胞系、草鱼吻端组织细胞株ZC-7901及其亚株ZC-7901S1、吻端成纤维细胞系PSF、草鱼尾鳍组织二倍体细胞系、草鱼囊胚细胞系、肝细胞系、鳔细胞系等几个细胞系。根据草鱼出血病病鱼所表现的症状及病理变化，大致可以将草鱼出血病分为“红肌肉型”、“红鳍红鳃盖型”、“肠炎型”三种类型，肌肉是易被GCRV感染的一个常见靶器官。但是，目前尚没有比较易于用于实验的草鱼肌肉细胞系。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一株草鱼肌肉细胞系及其应用。本专利技术所采取的技术方案是：一株草鱼肌肉组织细胞株，其保藏号是：CCTCCNO.C201833。该草鱼细胞株在呼肠孤病毒的分离、繁殖及病毒疫苗研制中的应用。一种草鱼细胞系的构建方法，其步骤是：1)取草鱼肌肉组织，灭菌处理，剪成碎末接种中，培养箱中干贴，加入细胞培养液培养，第6天细胞开始迁出；用PBS清洗，加入含EDTA的胰酶消化细胞，待细胞变圆后，用培养液洗脱，离心收集细胞培养，每2天更换培养液，至细胞长成80％-90％汇合的原代肌肉细胞；2)原代草鱼肌肉细胞铺满单层后，除去培养液，PBS清洗，以含EDTA的胰酶消化细胞，待细胞脱壁，吸去消化液，加入细胞培养液分散、悬起细胞，传代培养。优选的，灭菌处理的方法是：先用75％酒精中浸泡肌肉组织1～2min，用含有100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素的PBS溶液清洗优选的，消化细胞的含有EDTA的胰酶浓度为0.25％。优选的，原代细胞的收集方法是：待细胞开始从剪碎的肌肉组织迁出后3-4天，PBS清洗，加入胰酶消化细胞，用细胞培养液A洗脱，汇合细胞洗脱液，离心收集细胞至新的细胞瓶培养瓶中进行原代培养。优选的，传代培养的方法是：原代草鱼肌肉细胞铺满单层后，除去培养液，PBS清洗，以胰酶消化细胞，待细胞脱壁，吸去消化液，加入细胞培养液A分散、悬起细胞，以1：2进行传代，置28℃培养箱中传代培养；以后4～6天传代一次；第3代起，细胞培养液A中不再添加青霉素、链霉素成分；传至第10代，改用传代细胞培养液B，此时细胞系建成；传至第20代起，改用传代细胞培养液C。优选的，细胞培养液A是含有20ng/mLbFGF、1ng/mLEGF、100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素液，pH为7.0-7.4的M199培养基。优选的，细胞培养液B是含有10％FBS，20ng/mLbFGF，3ng/mLEGF的M199培养基。优选的，细胞培养液C是含有10％FBS的M199培养基。本专利技术的有益效果是：本专利技术公开了一株草鱼肌肉细胞系及其制备方法，该细胞系的构建方法较其它方法做出的改进为：待细胞从组织迁出后，将3-5瓶细胞经消化、离心收集后，汇总入新的细胞瓶培养，可提高单瓶活细胞数量，加速原代培养，减少细胞污染及死亡的可能，提高了细胞构建的成功率。本专利技术构建的草鱼肌肉细胞系的细胞类型为成纤维样，该细胞系细胞增殖速度快，可以连续传代，并可超低温冻存和复苏，染色体众数为48条，对草鱼呼肠孤病毒敏感，接种基因Ⅰ型GCRV后细胞病变效应(CPE)明显，不同基因型GCRV病毒在草鱼肌肉细胞系均增殖较快、D4时即达到较高浓度，细胞内病毒含量显著高于目前常用于分离GCRV的CIK、CO、PSF、EPC、GSB-E等细胞系(P＜0.05)。将该细胞系应用于转瓶培养法制备GCRV-873株病毒活疫苗时效率极高，不但使扩增的病毒含量提高(P＜0.05)，更缩短了疫苗生产制备所需的时间(6-8天)。因此，本专利技术的细胞系可很好地应用于草鱼呼肠孤病毒的分离、繁殖及草鱼出血病疫苗的研制。附图说明图1为显微镜下观察传代培养的草鱼肌肉细胞系：A为原代培养时从组织迁出的细胞；B为原代培养时汇总的3瓶细胞；C为长成80％-90％汇合的原代肌肉细胞；D为第3代细胞系；E为第10代细胞系；F为第120代细胞系。图2为第50代草鱼肌肉细胞系的生长曲线。图3为草鱼肌肉细胞系的染色体数目分布。图4为第60代草鱼肌肉细胞系感染基因Ⅰ型GCRV-873株病毒的图片：A为细胞感染病毒之前；B为病毒感染细胞2天；C为病毒感染细胞3天；D为病毒感染细胞7天；E为感染病毒的细胞电镜切片图。具体实施方式实施例草鱼肌肉组织细胞株，其保藏号是：CCTCCNO.C201833。其制备方法如下：1、制备细胞培养液细胞培养液①：选择M199培养基，加入胎牛血清(FBS)、人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)和青霉素、链霉素溶液，使细胞培养液含20％FBS(以下所述百分比若无特别说明，均为体积百分比，v/v％)，20ng/mLbFGF、1ng/mLEGF、100IU/mL、100μg/mL链霉素液，pH为7.0-7.4。细胞培养液②：M199培养基+10％FBS+20ng/mLbFGF+3ng/mLEGF细胞培养液③：M199培养基+10％FBS2、原代培养本专利技术所用草鱼(10±0.5cm)来源于中国水产科学研究院珠江水产研究所高要基地，约40日龄，原代细胞分离培养时间为2011年7月。取体长为10±0.5cm的约40日龄鲜活草鱼于75％酒精中浸泡1-2min，在无菌操作台中取出肌肉组织，将肌肉组织用PBS+100IU/mL青霉素+100μg/mL链霉素的溶液清洗三次，然后用眼科剪将肌肉组织剪成碎末，并将其均匀接种于25mL细胞培养瓶中，28℃培养箱中正置干贴，4h后加入4mL细胞培养液①，28℃培养，每2天更换培养液，第6天细胞开始迁出。第10天，用PBS清洗两遍，加入0.25％胰酶(含EDTA)1mL消化细胞，待光学显微镜下观察细胞变圆后，用培养液洗脱，汇合3-5瓶细胞洗脱液，1000rpm离心6min，收集细胞至新的细胞瓶培养，以后每2天更换培养液，第20天细胞长成80％-90％汇合的原代肌肉细胞。3、传代培养原代草鱼肌肉细胞铺满单层后，除去培养液，PBS清洗两遍，以1mL上述胰酶消化细胞，待肉眼可见细胞瓶边缘细胞脱壁，吸本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株草鱼肌肉组织细胞株，其保藏号是：CCTCC NO.C201833。

【技术特征摘要】
1.一株草鱼肌肉组织细胞株，其保藏号是：CCTCCNO.C201833。2.根据权利要求1所述的草鱼细胞株在呼肠孤病毒的分离、繁殖及病毒疫苗研制中的应用。3.一种草鱼细胞系的构建方法，其步骤是：1)取草鱼肌肉组织，灭菌处理，剪成碎末接种中，培养箱中干贴，加入细胞培养液培养，第6天细胞开始迁出；用PBS清洗，加入含EDTA的胰酶消化细胞，待细胞变圆后，用培养液洗脱，离心收集细胞培养，每2天更换培养液，至细胞长成80％-90％汇合的原代肌肉细胞；2)原代草鱼肌肉细胞铺满单层后，除去培养液，PBS清洗，以含EDTA的胰酶消化细胞，待细胞脱壁，吸去消化液，加入细胞培养液分散、悬起细胞，传代培养。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，灭菌处理的方法是：先用75％酒精中浸泡肌肉组织1～2min，用含有100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素的PBS溶液清洗。5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，消化细胞的含有EDTA的胰酶浓度为0.25％。6.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，原代细胞的收集方法是：待细胞开始从剪碎的肌肉组织...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘春花，赵长臣，江小燕，罗霞，黄志斌，陈总会，孙承文，巩华，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院珠江水产研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44