小分子化合物组合及利用该小分子化合物组合诱导分化的细胞制备软骨细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种小分子化合物组合及利用该小分子化合物组合诱导分化的细胞制备软骨细胞的方法。所述方法对分化的细胞定向诱导制备得到软骨细胞，定向诱导包括抑制赖氨酸脱乙酰基酶的活性，抑制TGF‑β的信号通路，抑制PKC活性，抑制DNA甲基转移酶活性，抑制组蛋白甲基转移酶活性；激活WNT/β‑catenin信号通路，激活cAMP信号通路，激活RA信号通路，所述小分子化合物组合包括调控所述信号通路和/或酶活性的化合物。本发明专利技术通过小分子化合物分阶段诱导，能够将分化的细胞转分化为软骨细胞，各步骤可实现精准质控，便于标准化操作和规模化生产。本发明专利技术提供的方法供体来源广泛，患者本人即可作为供体，可在较短时间内获得基础研究、临床治疗或组织工程生产所需的软骨细胞。

【技术实现步骤摘要】
小分子化合物组合及利用该小分子化合物组合诱导分化的细胞制备软骨细胞的方法
本专利技术涉及细胞生物学，组织工程和再生医学领域，尤其涉及一种小分子化合物组合及利用该小分子化合物组合诱导分化的细胞制备软骨细胞的方法。
技术介绍
关节软骨覆盖骨的端部并且为关节窝提供减震和润滑。作为无血管、无淋巴和无神经的组织，软骨具有较差的内在愈合能力。由于创伤或随年龄增长的软骨缺陷可导致骨关节炎(OA)等多种疾病，软骨损伤已造成全球性重大经济和社会问题，目前已成为第四大致残原因。据报道，美国30岁及以上人群中约有9％髋关节或膝关节OA患者，每年诊疗费用高达286亿美元。因此，安全有效的软骨修复技术或材料产业价值巨大。自体软骨细胞移植是目前修复关节软骨局灶性损伤的方法，但该方法因需要进行组织活检与采集健康软骨细胞而造成新的软骨缺损。此外，由于体外扩增软骨细胞会造成细胞去分化，使软骨细胞趋向于形成纤维化细胞，从而形成含有I型胶原的纤维性软骨组织，不利于修复缺损的软骨病灶。近年来，利用干细胞修复软骨损伤的研究逐渐增多，目前MSC已被确定为用于软骨损伤修复的最合适的细胞。但MSC具有随患者年龄增加增殖能力下降、从患者组织获得的细胞数量有限等局限，限制了其临床应用。通过诱导多潜能干细胞(iPSC)获得自体透明软骨细胞理论可行，但该技术引入外源基因和形成畸胎瘤风险的安全性问题目前仍未得到解决。多种分化的细胞如皮肤成纤维细胞具有来源丰富、易于获取并易于在体外长期大量扩增培养的优点。目前利用细胞转分化技术已经可以把分化的细胞如皮肤成纤维细胞直接诱导为成肌细胞、神经元、肝细胞、成骨细胞等多种不同类型的功能细胞；或先诱导为多能干细胞后，再进一步定向诱导为相应的功能细胞。上述采用细胞转分化技术从某种特定分化的细胞如皮肤成纤维细胞直接或间接诱导获得的功能细胞已经不再保持源细胞的分子特征与功能，但获得了相应目标细胞的典型分子特征与细胞功能。目前，上述诱导性功能细胞已逐渐应用于疾病模型研究、临床治疗研究与组织工程研究。传统的细胞转分化需要通过导入特定的外源性基因实现，有时还需要相应的小分子化合物、细胞因子或重组蛋白协同作用。文献已有较多采用特定外源性基因把某一分化的细胞诱导为另一功能性分化的细胞的报道。如文献已有采用BMP-2，BMP-7，LMP3单独或协同作用使皮肤成纤维细胞转分化为在体外、体内都具有骨形成作用的成骨细胞的报道。但导入外源性基因存在致瘤风险，并可能使目标细胞产生免疫原性，难以推广应用。2013年，邓宏魁报道仅采用小分子化合物或其组合可以实现鼠皮肤成纤维细胞重编程为神经细胞的转分化过程，并证实该细胞转分化技术具有诱导过程短、诱导系统稳定、易于质控、成本低、无外源性基因插入导致的致瘤风险、获得的目标细胞具有良好的安全性与稳定性且无免疫原性，具有潜在的临床应用价值与产业化前景。此后，申请号为201410075246.5的中国专利申请提供了一种把分化的细胞诱导转分化为神经干细胞的方法及其应用。具体地，该申请涉及采用组蛋白去乙酰化酶(HDACs)抑制剂、糖原合成酶激酶(GSK-3)抑制剂和转化生长因子β(TGF-β)信号通路抑制剂的组合，在正常生理低氧环境下诱导成纤维细胞、上皮细胞等分化的细胞转分化为具有良好多能性及传代稳定性的神经干细胞。申请号为201610213644.8的中国专利申请提供了一种诱导成纤维细胞转分化为心肌细胞的诱导培养基、方法及其应用，所述诱导培养基包含基础培养基和诱导小分子组合，所述诱导小分子组合为6TCFOW或SCFOV，其中6为E61541、T为苯环丙胺、C为CHIR99021、F为毛喉素、O为Dorsomorphin、W为IWR-1、S为SB431542、V为丙戊酸。该申请诱导培养基能够将成纤维细胞诱导转分化为心肌细胞。目前，通过采用单纯小分子化合物或其组合诱导人类分化的细胞如皮肤成纤维细胞获得施旺细胞(THOMAEC，etal，2014)、神经细胞(HUW，etal，2015)、胰岛细胞(ShengDing，etal，2015)的成果已陆续见诸报道。由于人类与小鼠存在约25％的基因差异，而将上述在小鼠细胞实验中获得成功的专利申请技术方案应用于人的同类细胞转分化可行性不高；另一方面，由于诱导同类细胞转分化获得不同目标细胞的具体理论基础与技术手段并不相同，申请人采用上述报道的技术方案分别重复试验，既未能把应用于小鼠细胞的转分化技术方案成功应用于人的同类细胞转分化，也未能把人类分化的细胞诱导转分化为软骨细胞。
技术实现思路
本专利技术提供一种小分子化合物组合及利用该小分子化合物组合诱导分化的细胞制备软骨细胞的方法。本专利技术利用小分子化合物组合分阶段处理分化的细胞，可以快速稳定程序化地制备大量软骨细胞或其产物。本专利技术第一方面，提供一种诱导分化的细胞制备软骨细胞的方法，所述方法对分化的细胞进行定向诱导制备得到软骨细胞，所述定向诱导包括抑制赖氨酸脱乙酰基酶的活性，抑制TGF-β(优选I型TGF-β受体参与的信号通路)的信号通路，抑制PKC的活性，抑制DNA甲基转移酶(DNMT)的活性，抑制组蛋白甲基转移酶(HistoneMethyltransferase，HMT)的活性；激活WNT/β-catenin的信号通路，激活cAMP(优选EPAC/RAP1)的信号通路，激活RA的信号通路。进一步地，所述定向诱导还包括抑制DNA甲基转移酶(DNMT)的活性和/或抑制组蛋白甲基转移酶(HistoneMethyltransferase，HMT)的活性,抑制JNK的信号通路和/或抑制ROCK的信号通路和/或激活smad4/smad5的信号通路和/或抑制组蛋白去甲基化酶制备得到软骨细胞。由于上述定向诱导处理对细胞的伤害较大，影响诱导率，进一步地，所述定向诱导前进行预处理，所述预处理包括抑制TGF-β的信号通路，激活WNT/β-catenin的信号通路和激活cAMP的信号通路；所述预处理包括抑制赖氨酸脱乙酰基酶的活性，抑制TGF-β的信号通路，激活WNT/β-catenin的信号通路和激活cAMP的信号通路。所述预处理过程用于活化分化的细胞，从而提高定向诱导阶段的细胞存活率。作为优选，所述方法包括预处理、第一阶段定向诱导和第二阶段定向诱导制备得到软骨细胞，所述预处理包括抑制TGF-β受体的信号通路，激活WNT/β-catenin的信号通路和激活cAMP的信号通路；或所述预处理包括抑制赖氨酸脱乙酰基酶的活性，抑制TGF-β受体的信号通路，WNT/β-catenin的信号通路和激活cAMP的信号通路；所述第一阶段定向诱导和第二阶段定向诱导均包括抑制赖氨酸脱乙酰基酶的活性，抑制TGF-β受体的信号通路，抑制PKC的活性，激活WNT/β-catenin的信号通路，激活cAMP的信号通路以及激活RA的信号通路；或所述第一阶段定向诱导和第二阶段定向诱导均包括赖氨酸脱乙酰基酶的活性，抑制TGF-β受体的信号通路，抑制PKC的活性，激活WNT/β-catenin的信号通路，激活cAMP的信号通路和激活RA的信号通路，以及抑制DNA甲基转移酶(DNMT)的活性和/或抑制组蛋白甲基转移酶(HistoneMethyltransferase，HMT)的活性和/或抑制J本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种诱导分化的细胞制备软骨细胞的方法，其特征在于，所述方法对分化的细胞进行定向诱导制备得到软骨细胞，所述定向诱导包括抑制赖氨酸脱乙酰基酶(Lysine deacetylases inhibitors，KDACIs)的活性，抑制TGF‑β的信号通路，抑制PKC的活性；激活WNT/β‑cate nin的信号通路，激活cAMP的信号通路以及激活RA的信号通路。

【技术特征摘要】
1.一种诱导分化的细胞制备软骨细胞的方法，其特征在于，所述方法对分化的细胞进行定向诱导制备得到软骨细胞，所述定向诱导包括抑制赖氨酸脱乙酰基酶(Lysinedeacetylasesinhibitors，KDACIs)的活性，抑制TGF-β的信号通路，抑制PKC的活性；激活WNT/β-catenin的信号通路，激活cAMP的信号通路以及激活RA的信号通路。2.如权利要求1所述的诱导分化的细胞制备软骨细胞的方法，其特征在于，所述定向诱导还包括抑制DNA甲基转移酶(DNMT)的活性和/或抑制组蛋白甲基转移酶(HistoneMethyltransferase，HMT)的活性,抑制JNK的信号通路和/或抑制ROCK的信号通路和/或激活smad4/smad5的信号通路和/或抑制组蛋白去甲基化酶制备得到软骨细胞。3.如权利要求1所述的诱导分化的细胞制备软骨细胞的方法，其特征在于，所述定向诱导前进行预处理，所述预处理包括抑制TGF-β的信号通路，激活WNT/β-catenin的信号通路和激活cAMP的信号通路；或所述预处理包括抑制赖氨酸脱乙酰基酶的活性，抑制TGF-β的信号通路，激活WNT/β-catenin的信号通路和激活cAMP的信号通路。4.如权利要求2所述的诱导分化的细胞制备软骨细胞的方法，其特征在于，所述方法包括预处理、第一阶段定向诱导和第二阶段定向诱导制备得到软骨细胞，所述预处理包括抑制TGF-β受体的信号通路，激活WNT/β-catenin的信号通路和激活cAMP的信号通路；或所述预处理包括抑制赖氨酸脱乙酰基酶的活性，抑制TGF-β受体的信号通路，WNT/β-catenin的信号通路和激活cAMP的信号通路；所述第一阶段定向诱导和第二阶段定向诱导均包括抑制赖氨酸脱乙酰基酶的活性，抑制TGF-β受体的信号通路，抑制PKC的活性，激活WNT/β-catenin的信号通路，激活cAMP的信号通路以及激活RA的信号通路；或所述第一阶段定向诱导和第二阶段定向诱导均包括赖氨酸脱乙酰基酶的活性，抑制TGF-β受体的信号通路，抑制PKC的活性，激活WNT/β-catenin的信号通路，激活cAMP的信号通路和激活RA的信号通路，以及抑制DNA甲基转移酶(DNMT)的活性和/或抑制组蛋白甲基转移酶(HistoneMethyltransferase，HMT)的活性和/或抑制JNK的信号通路和/或抑制ROCK的信号通路和/或激活smad4/smad5的信号通路和/或抑制组蛋白去甲基化酶制备得到软骨细胞。5.如权利要求1～4任一所述的诱导分化的细胞制备软骨细胞的方法，其特征在于，所述分化的细胞进行定向诱导时还需加入细胞生长因子BMP4和/或PDGF-AB和/或碱性成纤维细胞生长因子b-FGF蛋白。6.一种小分子化合物组合，其特征在于，所述小分子化合物组合包括用于调控或按时序分阶段调控权利要求1～5任一所述中的信号通路和/或酶活性的化合物。7.如权利要求6所述的小分子化合物组合，其特征在于，所述赖氨酸脱乙酰基酶抑制剂包括sodiumphenylbutyrate，butyrate，sodiumbutyrate，MC1568，CI994(Tacedinaline)，chidamide，CAY10683(SantacruzaMateA)，CUDC-907，M344(HistoneDeacetylaseInhibitorIII)，LAQ824(NVP-LAQ824，Dacinostat)，Pracinostat(SB939)，VPA，Scriptaid，Apicidin，LBH-589(Panobinostat)，MS-275，SAHA(Vorinostat)，Trichostatin(TSA)，PsammaplinA，PCI-24781(Abexinostat)，Rocilinostat(ACY-1215)，Mocetinostat(MGCD0103)，4-Phenylbutyrate(4PB)，splitomicin，SRT1720，resveratrol，Sirtinol，APHA，CI-994，Depudecin，FK-228，HC-Toxin，ITF-2357(Givinostat)，Chidamide，RGFP966，PHOB，BG45，NexturastatA，TMP269，CAY10603，MGCD-0103，Niltubacin，PXD-101(Belinostat)，Pyroxamide，Tubacin，EX-527，BATCP，Cambinol，MOCPAC，PTACH，MC1568，NCH51和TC-H106中的至少一种；所述TGF-β信号通路的抑制剂包括616452，LY2109761，Pirfenidone，Repsox(E-616452)，SB431542，A77-01，Tranilast，Galunisertib(LY2157299)，A8301，GW788388，ITD-1，SD208，SB525334，LY364947，ASP3029，D4476和SB505124中的至少一种；所述PKC抑制剂包括Go6983，Ro31-8220Mesylate，Go6976和BisindolylmaleimideI(GF109203X)的至少一种；所述WNT/β-catenin信号通路的激活剂包括MAY-262611，CHIR98014，CHIR99021，LiCl，Li2CO3，TD114-2，AZD2858，AZD1080，BIO，Kenpaullone，TWS119，LY2090314，CBM1078，SB216763和AR-A014418中的至少一种；所述cAMP激活剂包括EPAC/RAP1激活剂，8-Bromo-cAMP，Dibutyryl-Camp和Sp-8-Br-cAMPs中的至少一种；所述EPAC/RAP1信号通路的激活剂包括Forskolin，IBMX，ProstaglandinE2(PGE2)，NKH477，8-pCPT-2′-O-Me-cAMP，GSK256066，Apremilast(CC-10004)，Roflumilast，Cilomilast，Rolipram和Milrinone中的至少一种；所述RA信号通路的激活剂包括TTNPB，Bexarotene，Ch55，Tamibarotene，Retinol，AM580，ATRA，VitaminA，VitaminA衍生物和13-cisRA中的至少一种；所述ROCK信号通路的抑制剂包括Y-27632，Y-276322HCl，Thiazovivin，Ripasudil(K-115)，Fasudil，Fasudil(HA-1077)HCl，GSK429286A，RKI-1447和PKI-1313中的至少一种；所述JNK信号通路的抑制剂包括SP600125，JNKInhibitorIX，AS601245，AS602801和JNK-IN-8中的至少一种；所述DNMT抑制剂包括RG108，Thioguanine，5-Aza-2'-deoxycytidine(Decitabine)，SGI-1027，Zebularine，和5-Azacytidine(AZA)中的至少一种；所述HMT抑制剂包括EPZ004777，EPZ5676，GSK503，BIX01294和SGC0946中的至少一种；所述组蛋白去甲基化酶抑制剂包括parnate(tranylcypromine)，Tranylcypromine(2-PCPA)HCl，SP2509，4SC-202，ORY-1001(RG-6016)，GSKJ1和GSK-LSD1中的至少一种；所述smad4/smad5信号通路的激活剂为Kartogenin。8.如权利要求6所述的小分子化合物组合，其特征在于，所述小分子化合物组合采用下列组合中的任一项：VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+Go6983+TTNPB+EPZ004777+AM580；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+Go6983+TTNPB+EPZ004777+5-Aza-2'-deoxycytidine；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+Go6983+TTNPB+EPZ004777+AM580+5-Aza-2'-deoxycytidine；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+Go6983+TTNPB+EPZ004777+5-Aza-2'-deoxycytidine+SP600125；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+Go6983+TTNPB+EPZ004777+5-Aza-2'-deoxycytidine+SP600125+AM580；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+Go6983+TTNPB+EPZ004777+SP600125；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+Go6983+TTNPB+EPZ004777+AM580+SP600125；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+Go6983+TTNPB+EPZ004777+AM580+SP600125+Y-27632；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+Go6983+TTNPB+EPZ004777+AM580+SP600125+Y-27632+5-Aza-2'-deoxycytidine；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+Go6983+TTNPB+EPZ004777+AM580+SP600125+Y-27632+5-Aza-2'-deoxycytidine+ascorbate；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+Go6983+TTNPB+EPZ004777+AM580+SP600125+Y-27632+ascorbate；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+Go6983+TTNPB+EPZ004777+AM580+Y-27632+ascorbate；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+Go6983+TTNPB+EPZ004777+AM580+Y-27632+ascorbate+5-Aza-2'-deoxycytidine；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+Go6983+TTNPB+EPZ004777+Parnate；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+Go6983+TTNPB+EPZ004777+AM580+Parnate；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+Go6983+TTNPB+EPZ004777+5-Aza-2'-deoxycytidine+Parnate；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+Go6983+TTNPB+EPZ004777+AM580+5-Aza-2'-deoxycytidine+Parnate；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+Go6983+TTNPB+EPZ004777+5-Aza-2'-deoxycytidine+SP600125+Parnate；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+Go6983+TTNPB+EPZ004777+5-Aza-2'-deoxycytidine+SP600125+AM580+Parnate；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+Go6983+TTNPB+EPZ004777+S...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡敏，李燕皎，王兆杰，
申请(专利权)人：昆明学院，云南省科学技术院，
类型：发明
国别省市：云南,53