一种体外诱导带血管蒂的脂肪组织成肌方法技术

本发明专利技术涉及一种体外诱导带血管蒂的脂肪组织成肌方法，该方法利用带血管蒂的脂肪筋膜组织作为活体支架，原位诱导成熟脂肪细胞为主体的种子细胞经生肌培养液体外灌注转分化成骨骼肌细胞，体外构建轴形血管化组织工程骨骼肌组织。本发明专利技术的有益效果是在最大程度减轻机体损伤的前提下，培育轴型血管化组织工程骨骼肌组织，用以治疗肌肉缺损。

A method of inducing adipose tissue myogenesis with vascular pedicle in vitro

The present invention relates to a method of inducing adipose tissue with vascular pedicle in vitro. This method uses the adipose fascia tissue with vascular pedicle as a living scaffold, and in situ induction of mature adipocytes as the main body of the seed cells transdifferentiated into skeletal muscle cells through the myosculturing fluid, and constructing the axonized vascular tissue engineering in vitro. Skeletal muscle tissue. The beneficial effect of the invention is to cultivate the skeletal muscle tissue of the axial vascularized tissue engineering to treat the muscle defect on the premise of minimizing the damage to the body.

【技术实现步骤摘要】
一种体外诱导带血管蒂的脂肪组织成肌方法
本专利技术属于外科医学
，具体涉及一种体外诱导带血管蒂的脂肪组织成肌方法。
技术介绍
因各种自然灾害、意外伤害、火器伤等因素常造成的大范围人群创伤，以及肿瘤切除和包括肌营养不良或脊髓性肌萎缩在内的骨骼肌病，都存在显著肌肉组织损失，其修复是临床上较为棘手的问题。目前临床治疗主要是通过自体肌肉组织移植，作为形态和功能替代。然而，此方法可用的肌肉有限，并对供区造成损伤，造成供区肌肉体积不足或功能丧失。故亟需研究能够在短时间获得大量的组织工程化肌肉组织的构建方法，为满足群体性、大量肌肉组织缺损修复的需要。随着肌肉组织工程深入研究，为肌肉组织的缺损修复提供又一发展方向。肌肉组织工程避免了自体移植造成的肌体损伤，异体移植的免疫排斥，以及人工代用品的异物反应和感染等缺点，可以最少量的组织细胞甚至可用组织穿刺的方法获得，经体外培养扩增后，并按组织、器官缺损情况任意塑型，来修复组织缺损，达到真正意义上的功能重建和较好的形态修复。现行的组织工程骨骼肌构建方法仅使用单纯骨骼肌卫星细胞接种，虽然能够形成骨骼肌，但无论从形成新生骨骼肌的数量还是质量上来讲均不能满足临床修复大范围骨骼肌缺损的需要。因此，如何在构建组织工程骨骼肌的同时促进血管和神经的长入，就成为骨骼肌组织工程深入研究和走向应用的关键性环节。
技术实现思路
为了解决
技术介绍
中提到的使用单纯骨骼肌卫星细胞接种，虽然能够形成骨骼肌，但无论从形成新生骨骼肌的数量还是质量上来讲均不能满足临床修复大范围骨骼肌缺损需要的技术缺陷，本专利技术提供了一种体外诱导带血管蒂的脂肪组织成肌方法，该方法在最大程度减轻机体损伤的前提下，培育轴型血管化组织工程骨骼肌组织，用以治疗肌肉缺损。本专利技术利用带血管蒂的脂肪筋膜组织作为活体支架，在体外，利用灌注式生物反应器促进营养物质交换，并模拟体内力学环境，维持大体积脂肪筋膜组织体外长期存活。接受生肌培养液灌注的脂肪筋膜组织，其内的脂肪间充质干细胞和成熟的脂肪细胞将被诱导分化成为骨骼肌组织，最终获得成熟的大块组织工程肌肉。本专利技术所采用的技术方案是：一种体外诱导带血管蒂的脂肪组织成肌方法，该方法利用带血管蒂的脂肪筋膜组织作为活体支架，原位诱导成熟脂肪细胞为主体的种子细胞经生肌培养液体外灌注转分化成骨骼肌细胞，体外构建轴形血管化组织工程骨骼肌组织。进一步地，所述血管蒂为轴形血管蒂。进一步地，所述原位诱导成熟脂肪细胞为主体的种子细胞经生肌培养液体外灌注转分化成骨骼肌细胞，进而转化为骨骼肌组织的实现方法是：所述轴形血管蒂为所述脂肪筋膜组织提供充足血供；利用灌注式生物反应器，模拟体内骨骼肌组织间液流动所产生的力学环境；所述灌注式生物反应器包括生肌培养液，在所述生肌培养液中将所述脂肪筋膜组织内的脂肪间充质干细胞和成熟的脂肪细胞诱导分化成为骨骼肌组织，促进大块组织工程肌肉成熟。进一步地，所述灌注式生物反应器，主要由贮液瓶、蠕动泵和连接管道组成；所述连接管道与所述脂肪筋膜组织的轴形血管蒂相连通，且所述蠕动泵连接在所述连接管道中提供泵送压力，与所述蠕动泵的吸入口相连的所述连接管道的端口插入到所述贮液瓶中的所述生肌培养液内，所述连接管道的另一端口设置在所述贮液瓶内。进一步地，所述灌注式生物反应器放置于37℃的二氧化碳培养箱中，通过所述蠕动泵持续驱动，使生肌培养液持续通过所述脂肪筋膜组织。进一步地，所述灌注式生物反应器中的生肌培养液在灌注过程中维持恒定pH值和氧浓度。进一步地，所述生肌培养液采用Dulbeccos改良Eagle培养基或F12培养基，所述Dulbeccos改良Eagle培养基或所述F12培养基中含有小牛血清、马血清、青霉素或链霉素、地塞米松、氢化可的松以及4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲剂。需要说明的是Dulbeccos改良Eagle培养基简称DMEM；4-羟乙基哌嗪乙磺酸的英文名为HEPES。进一步地，所述血管蒂的脂肪筋膜组织的获取采用如下方法：分离出带血管蒂的脂肪筋膜组织后，使用肝素生理盐水冲洗，以粗针穿刺血管后，将脂肪筋膜组织置于灌注式生物反应器中，离断近心端血管。使用肝素生理盐水冲洗的目的是预防微血栓形成。本专利技术还提供一种用于肌肉缺损修复的方法，采用上述的体外诱导带血管蒂的脂肪组织成肌方法获得的轴形血管化组织工程骨骼肌组织进行肌肉缺损修复。本专利技术还提供一种构建大体积组织工程骨组织和组织工程软骨组织的方法，采用上述的体外诱导带血管蒂的脂肪组织成肌方法获得的轴形血管化组织工程骨骼肌组织进行构建。本专利技术的技术效果如下：通过本专利技术方法获得的轴形血管化组织工程骨骼肌组织用于肌肉缺损修复，可最大程度减轻机体损伤，具有下述特点：(1)体外构建轴型血管化骨骼肌组织，能够彻底避免自体提供肌肉造成的损伤；(2)本专利技术利用大体积脂肪筋膜作为天然活体支架，诱导分化其内脂肪间充质干细胞和成熟的脂肪细胞，可直接获得成熟的大体积组织工程肌肉；(3)本专利技术采用地塞米松、氢化考的松、小牛血清、马血清等诱导成肌分化，与传统使用的5-氮杂胞苷相比，前者控制条件易掌握、分化充分、毒性明显减小，有利于肌肉缺损修复。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本专利技术带血管蒂的脂肪筋膜手术处理状态图；图2是本专利技术的灌注式生物反应器连接示意图。附图标记说明如下：1、腹壁浅动脉；2、腹壁浅静脉；3、股动脉；4、股静脉；5、注射器；6、扎结；7、贮液瓶；8、蠕动泵；9、连接管道。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本专利技术所保护的范围。本专利技术利用带血管蒂的脂肪筋膜组织作为活体支架，在体外，利用灌注式生物反应器促进营养物质交换，并模拟体内力学环境，维持大体积脂肪筋膜组织体外长期存活。接受生肌培养液灌注的脂肪筋膜组织，其内的脂肪间充质干细胞和成熟的脂肪细胞将被诱导分化成为骨骼肌组织，最终获得成熟的大块组织工程肌肉。具体地，体外诱导带血管蒂的脂肪组织成肌方法，采用如下步骤实现：步骤一、选择具有明确血管供应的脂肪筋膜瓣供区；步骤二、如图1所示，以腹股沟脂肪筋膜组织(即脂肪筋膜组织)为例，设计平行腹股沟韧带切口，暴露腹股沟脂肪筋膜组织，结扎(或电凝)双侧股动脉3及远心端股静脉4，形成扎结6，分离脂肪筋膜组织，从股动脉3近心端使用注射器5进行肝素生理盐水灌洗，后离断已结扎血管，粗针穿刺股动脉3，掀起脂肪筋膜组织置于含有生肌培养液的灌注式生物反应器中，使用血管钳将漂浮的脂肪筋膜组织压入培养液中，离断近心端股静脉4；步骤三、配置生肌培养液：采用DMEM或F12培养基，培养基中至少含有小牛血清、马血清、青霉素或链霉素、地塞米松、氢化可的松以及HEPES缓冲剂；具体生肌培养液成分见下表：注：DMEM：Dulbeccos改良Eagle培养基；HE本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种体外诱导带血管蒂的脂肪组织成肌方法；其特征在于，该方法利用带血管蒂的脂肪筋膜组织作为活体支架，原位诱导成熟脂肪细胞为主体的种子细胞经生肌培养液体外灌注转分化成骨骼肌细胞，体外构建轴形血管化组织工程骨骼肌组织。

【技术特征摘要】
1.一种体外诱导带血管蒂的脂肪组织成肌方法；其特征在于，该方法利用带血管蒂的脂肪筋膜组织作为活体支架，原位诱导成熟脂肪细胞为主体的种子细胞经生肌培养液体外灌注转分化成骨骼肌细胞，体外构建轴形血管化组织工程骨骼肌组织。2.根据权利要求1所述的体外诱导带血管蒂的脂肪组织成肌方法，其特征在于，所述血管蒂为轴形血管蒂。3.根据权利要求2所述的体外诱导带血管蒂的脂肪组织成肌方法，其特征在于，所述原位诱导成熟脂肪细胞为主体的种子细胞经生肌培养液体外灌注转分化成骨骼肌细胞，进而转化为骨骼肌组织的实现方法是：所述轴形血管蒂为所述脂肪筋膜组织提供充足血供；利用灌注式生物反应器，模拟体内骨骼肌组织间液流动所产生的力学环境；所述灌注式生物反应器包括生肌培养液，在所述生肌培养液中将所述脂肪筋膜组织内的脂肪间充质干细胞和成熟的脂肪细胞诱导分化成为骨骼肌组织，促进大块组织工程肌肉成熟。4.根据权利要求3所述的体外诱导带血管蒂的脂肪组织成肌方法，其特征在于，所述灌注式生物反应器，主要由贮液瓶、蠕动泵和连接管道组成；所述连接管道与所述脂肪筋膜组织的轴形血管蒂相连通，且所述蠕动泵连接在所述连接管道中提供泵送压力...

【专利技术属性】
技术研发人员：安阳，李东，陈鹿嘉，聂芳菲，薛红宇，秦泽莲，李比，
申请(专利权)人：北京大学第三医院，
类型：发明
国别省市：北京,11