一种两步法建立间充质干细胞软骨分化后骨关节炎样细胞模型的方法技术

本发明专利技术公开了一种两步法建立间充质干细胞软骨定向分化后骨关节炎细胞模型的方法。该方法首先诱导间充质干细胞定向分化为关节软骨细胞，然后采用IL‑1β体外诱导所得软骨细胞建立骨关节炎模型。本发明专利技术首次使用两步法建立软骨定向分化后骨关节炎模型，通过考察软骨细胞形态学和表型基因aggrecan、Col2α1表达改变，确定了溶液的最佳使用浓度和细胞诱导时间。本方法操作容易、成本较低，可用于间充质干细胞软骨定向分化后的细胞质量评估、成年骨关节炎易感的早期预警、骨关节炎药物作用靶标的验证以及药物毒性/药效的筛选等相关研究。

A two step method for establishing osteoarthritis like cell model of mesenchymal stem cells after cartilage differentiation

The invention discloses a method for establishing osteoarthritis cell model of mesenchymal stem cells chondrocytes after directional differentiation by two step method. This method first induces mesenchymal stem cells to differentiate into articular chondrocytes, and then uses IL 1 beta in vitro to induce osteoarthritis model of the chondrocytes. For the first time, the two step method was used to establish a model of osteoarthritis of cartilage after differentiation. By examining the changes in the expression of chondrocyte morphology and phenotype gene aggrecan and Col2 alpha 1, the optimum concentration of the solution and the time of cell induction were determined. This method is easy to operate and has low cost. It can be used for the evaluation of cell quality after differentiation of mesenchymal stem cells, early warning of susceptibility to osteoarthritis of adult bone, test of drug action target of osteoarthritis, and screening of drug toxicity / efficacy.

【技术实现步骤摘要】
一种两步法建立间充质干细胞软骨分化后骨关节炎样细胞模型的方法
本专利技术属于细胞模型
，涉及一种两步法建立间充质干细胞软骨定向分化后骨关节炎样细胞模型的方法。
技术介绍
骨关节炎是中老年人的常见病和多发病，是一种以关节软骨慢性退行性病变为主要病理特征的关节疾病，是老年人群疼痛和致残的主要原因。在美国50岁以上人群中，骨关节炎的发病率位居第二位，仅次于心血管疾病，累计约2100万人，每年用于直接和间接治疗骨关节炎的医疗费用约546至650亿美元[1]。我国总人口中骨关节炎的发病率约为4％，主要集中在老龄人群当中，在65岁以上人群中大于50％，在75岁以上人群中大于80％[2]。传统观点认为，骨关节炎为老年退行性疾病。目前大样本流行病学研究发现，低出生体重儿成年后手、髋等多关节的骨关节炎易感[3-5]。我们前期的大量研究证实，孕期外源物(如咖啡因、尼古丁和乙醇)暴露和摄食限制可引起子代大鼠关节软骨发育不良及成年骨关节炎易感[6-9]。提示，骨关节炎具有宫内起源。目前针对骨关节炎的干细胞相关研究主要集中在骨关节炎发生之后干细胞作为种子细胞进行的细胞移植治疗，而将干细胞应用于胎源性成年骨关节炎的早期预警技术的相关研究尚未见报道。已证实，多种干细胞可定向分化成关节软骨细胞；在骨关节炎发病早期，白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)大量存在于滑液中，并参与了软骨的损伤[10,11]。既往有关成年骨关节炎的体外研究均是以IL-1β处理软骨细胞(细胞系或原代细胞)来进行炎症造模，以探讨成年骨关节炎的相关机制和防治靶标。因此，结合以往的文献报道，我们针对分化后软骨细胞基质含量和对炎症因子刺激的耐受能力，提出了一种新的两步法建立间充质干细胞软骨分化后骨关节炎样细胞模型的方法。参考文献：1.Helmick,C.G.,etal.,EstimatesoftheprevalenceofarthritisandotherrheumaticconditionsintheUnitedStates.PartI.ArthritisRheum,2008.58(1):p.15-25.2.李儒军,林剑浩,骨关节炎流行病学的研究进展.中国临床医生,2010.38(7):p.6-10.3.Clynes,M.A.,etal.,Furtherevidenceofthedevelopmentaloriginsofosteoarthritis:resultsfromtheHertfordshireCohortStudy.JDevOrigHealthDis,2014.5(6):p.453-8.4.Poole,J.,etal.,Birthweight,osteoarthritisofthehand,andcardiovasculardiseaseinmen.AnnRheumDis,2003.62(10):p.1029；authorreply1029.5.Sayer,A.A.,etal.,Weightfrombirthto53years:alongitudinalstudyoftheinfluenceonclinicalhandosteoarthritis.ArthritisRheum,2003.48(4):p.1030-3.6.Luo,H.W.,etal.,Prenatalcaffeineexposureinducesapoorqualityofarticularcartilageinmaleadultoffspringratsviacholesterolaccumulationincartilage.SciRep2015.5:17746.7.Tie,K.,etal.,Intrauterinelow-functionalprogrammingofIGF1byprenatalnicotineexposuremediatesthesusceptibilitytoosteoarthritisinfemaleadultratoffspring.TheFASEBJ2016；30(2):785-97.8.Ni,Q.B.,etal.,Prenatalethanolexposureincreasesosteoarthritissusceptibilityinfemaleratoffspringbyprogrammingalow-functioningIGF-1signalingpathway.SciRep2015；5:147119.Tan,Y.,etal.,Prenatalfoodrestrictioninducespoor-qualityarticularcartilageinfemaleratoffspringfedapost-weaninghigh-fatdietanditsintra-uterineprogrammingmechanisms.BrJNutr.2016；116(8):1346-55.10.Rhee,J.,etal.,InhibitionofBATF/JUNtranscriptionalactivityprotectsagainstosteoarthriticcartilagedestruction.AnnRheumDis,2017.76(2):p.427-434.11.Benito,M.J.,etal.,Synovialtissueinflammationinearlyandlateosteoarthritis.AnnRheumDis,2005.64(9):p.1263-7.
技术实现思路
为了克服现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种利用含有一定浓度IL-1β的培养基处理间充质干细胞软骨细胞定向分化后的细胞一定时间，从而进行骨关节炎造模的方法，该方法操作容易、成本较低。该方法既可以用于评估间充质干细胞软骨定向分化后的细胞质量及早期预警成年骨关节炎的易感性，也可以用于研究骨关节炎药物的作用靶标以及进行药物毒性/药效的筛选。本专利技术的第一方面，提供一种建立间充质干细胞软骨定向分化后骨关节炎样细胞模型的方法，包括如下步骤：(1)建立间充质干细胞软骨细胞定向分化模型：采用低3代间充质干细胞在体外37℃、湿度95％、CO2浓度5％的细胞培养箱内培养21天，其间隔天更换软骨分化培养基一次，将充质干细胞向软骨定向分化，获得软骨细胞，不限所用支架；(2)使用含重组人IL-1β的DMEM/F12培养基处理步骤(1)定向分化后的细胞进行骨关节炎造模；(3)模型的评估：如果检测到步骤(2)建立的细胞模型中软骨表型基因aggrecan和Col2α1的表达下降，阿利新蓝和番红O染色变浅，则该模型建立成功。优选地，上述步骤(1)中以海藻酸钠微球作为生物支架对间充质干细胞进行三维培养，微球制备完成后，以普通完全培养基培养24小时，然后加入软骨分化培养基进行诱导分化，诱导21天；其中，软骨分化培养基的成分为：95％DMEM/F12培养基、5％Gibco小牛血清、1％100×ITS、100nM地塞米松、10ng/mLTGFβ1、40μg/mL脯氨酸、50μg/mL抗坏血酸、100mg/L丙酮酸和10％青链霉素。优选地，步骤(2)中使用含重组人IL-1β10ng本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种建立间充质干细胞软骨定向分化后骨关节炎样细胞模型的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)建立间充质干细胞软骨细胞定向分化模型：采用第3代间充质干细胞在体外37℃、湿度95％、CO2浓度5％的细胞培养箱内培养21天，其间隔天更换软骨分化培养基一次，将间充质干细胞向软骨定向分化，获得软骨细胞，不限所用支架；2)使用含重组人IL‑1β的DMEM/F12培养基处理步骤1)定向分化后的细胞进行骨关节炎造模；3)模型的评估：如果检测到步骤2)建立的细胞模型中软骨表型基因aggrecan、Col2α1的表达下降以及阿利新蓝、番红O染色变浅，则该模型建立成功。

【技术特征摘要】
1.一种建立间充质干细胞软骨定向分化后骨关节炎样细胞模型的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)建立间充质干细胞软骨细胞定向分化模型：采用第3代间充质干细胞在体外37℃、湿度95％、CO2浓度5％的细胞培养箱内培养21天，其间隔天更换软骨分化培养基一次，将间充质干细胞向软骨定向分化，获得软骨细胞，不限所用支架；2)使用含重组人IL-1β的DMEM/F12培养基处理步骤1)定向分化后的细胞进行骨关节炎造模；3)模型的评估：如果检测到步骤2)建立的细胞模型中软骨表型基因aggrecan、Col2α1的表达下降以及阿利新蓝、番红O染色变浅，则该模型建立成功。2.根据权利要求1所述的建立间充质干细胞软骨定向分化后骨关节炎样细胞模型的方法，其特征在于，上述步骤1)中以海藻酸钠微球作为生物支架对间充质干细胞进行三维培养，微球制备完成后，以普通完全培养基培养24小时，然后加入软骨分化培养基进行诱导分化，诱导21天；其中，软骨分化培养基的成分为：95％DMEM/F12培养基、5％Gibco小牛血清、1％100×ITS、100nM地塞米松、...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪晖，陈廖斌，齐勇建，杨旭，何波，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42