检测25-羟基维生素D的荧光层析试剂盒及其定量检测方法技术

本发明专利技术公开一种检测25‑羟基维生素D的荧光层析试剂盒及其定量检测方法，其中，所述检测25‑羟基维生素D的荧光层析试剂盒包括试纸条，试纸条包括PVC衬板、硝酸纤维素膜、偶合物结合垫片、样本垫片及吸水垫片，PVC衬板上粘贴有硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜的一端粘贴有偶合物结合垫片，另一端粘贴有吸水垫片，偶合物结合垫片上粘贴有样本垫片；硝酸纤维素膜上设有测试带和控制带，测试带包被有鼠抗25‑羟基维生素D抗体，控制带包被有兔抗鼠抗体；偶合物结合垫片包被有荧光标记25‑羟基维生素D抗体。本发明专利技术的检测25‑羟基维生素D的荧光层析试剂盒灵敏度高、稳定性好，有利于进行临床推广应用。

Fluorescence chromatograph kit for detecting 25- hydroxyvitamin D and its quantitative detection method

The present invention discloses a fluorescence chromatography kit for detecting 25 hydroxyl vitamin D and a quantitative detection method, in which the fluorescent chromatograph kit for detecting 25 hydroxyl vitamin D includes a test paper strip, and the test paper includes a PVC liner, a nitrocellulose membrane, a coupling gasket, a sample pad and a water absorbent pad, and a PVC liner. A nitrocellulose membrane was pasted, one end of the nitrocellulose membrane was pasted with a coupling mat, a water absorbent pad was attached to the other end, and a sample washer was attached to the coupling on the gasket; a test belt and a control belt were attached to the nitrocellulose membrane, and the test band was tested against 25 anti hydroxyvitamin D antibody and the control band was covered with rabbits. Anti mouse antibodies; conjugates with gaskets were labeled with fluorescent labeled 25 hydroxyvitamin D antibody. The fluorescent chromatograph kit for detecting 25 hydroxyvitamin D has high sensitivity and good stability, and is conducive to clinical popularization and application.

【技术实现步骤摘要】
检测25-羟基维生素D的荧光层析试剂盒及其定量检测方法
本专利技术涉及医学检验领域，特别涉及一种检测25-羟基维生素D的荧光层析试剂盒及其定量检测方法。
技术介绍
维生素D为类固醇衍生物，属脂溶性维生素。人体内的维生素D主要由皮肤受紫外线照射后合成，只有少部分通过从食物或补充品中摄入，25-羟基维生素D是维生素D在人体内的主要存在形式。研究证实维生素D不仅只是影响钙磷代谢，而且还具有广泛的生理作用，其在维持人体的健康、细胞的生长和发育方面不可或缺，维生素D与多种疾病密切相关。而25-羟维生素D是代谢中的主要循环形式，能反映机体的维生素D储存水平并与维生素D缺乏的临床症状相关联，因此25-羟基维生素D是衡量维生素D体内水平的最可靠的临床指标。25-羟基维生素D检测的临床应用主要与佝偻病(儿童)，骨软化症、绝经后骨质疏松和肾性骨病的诊断、治疗和监测有关。目前25-羟维生素D的测定方法主要有酶联免疫法、放射免疫法、液相色谱-质谱检测法以及化学发光法。酶联免疫法自动化程度不高，且受人为因素影响较大。放射免疫法存在着环境污染问题；液相色谱质谱操作复杂，用时较长；而化学发光法灵敏度虽高，但这种方法学对仪器的要求较高，试剂为大包装，必须低温保存；因此限制了其在临床上的应用，特别是在基层医院的推广应用。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是提出一种检测25-羟基维生素D的荧光层析试剂盒及其定量检测方法，具有操作简单、灵敏度高、稳定性好的特点，有利于进行临床推广应用，特别适合在基层医院、诊所以及体检中心等单位使用。为实现上述目的，本专利技术提出的检测25-羟基维生素D的荧光层析试剂盒，包括试纸壳和样本稀释液，所述试纸壳上设置有加样窗口和检测窗口，所述试纸壳内设有试纸条，所述试纸条包括PVC衬板、硝酸纤维素膜、偶合物结合垫片、样本垫片及吸水垫片，所述PVC衬板上粘贴有硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜的一端粘贴有偶合物结合垫片，另一端粘贴有吸水垫片，所述偶合物结合垫片上粘贴有样本垫片；所述硝酸纤维素膜上设置有测试带和控制带，所述测试带内包被有鼠抗25-羟基维生素D抗体，所述控制带内包被有兔抗鼠抗体；所述偶合物结合垫片包被有荧光标记25-羟基维生素D抗体；其中，所述样本垫片位于所述加样窗口处，所述测试带和所述控制带位于所述检测窗口处。优选地，所述硝酸纤维素膜按如下步骤制备：分别将测试带抗体原液和控制带抗体原液在4℃下以6000～13000r/min速度离心60min，吸取两种上清液；将两种上清液分别装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分后，超滤浓缩后装瓶冷冻，得到测试带抗体和控制带抗体；用pH值为6.5～6.7的磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液分别稀释两种抗体，得到0.8mg/ml测试带包被液和0.8mg/ml控制带包被液；将所述测试带包被液和所述控制带包被液分别喷涂在硝酸纤维素膜对应的测试带和控制带位置，喷涂量为1μL/cm；再将包被好硝酸纤维素膜置于37℃温度下烘干。优选地，所述磷酸盐缓冲液按重量计包括：Na2HPO40.263-0.376份，KH2PO41.000-1.109份，NaCl6份，KCl0.2份，蒸馏水1000份；所述Tris缓冲液按重量计包括：三羟甲基氨基甲烷4.6-5.5份，KH2PO42.0-3.0份，NaCl8份，KCl0.4份，牛血清白蛋白9份，蒸馏水1200份。优选地，所述偶合物结合垫片按如下步骤制备：用pH值为6.4～6.6的MES溶液洗涤荧光微球，8000～15000r/min速度离心30min，去除上清液，重复操作两次；用MES溶液重悬荧光微球，并加入活化剂EDC，活化30min；用pH值为6.4～6.6的MES溶液洗涤活化的荧光微球，8000～15000r/min速度离心30min，去除上清液，重复操作两次；用pH值为8.5～9.5的硼酸溶液重悬活化的荧光微球，加入25-羟基维生素D鼠单克隆抗体，室温下震荡混匀，8000～15000r/min速度离心30min，去除上清液；用质量分数为5％的BSA溶液重悬活化的荧光微球，室温下震荡反应1h，8000～15000r/min速度离心30min，去除上清液；用pH值为8.5～9.5的硼酸溶液重悬活化的荧光微球，8000～15000r/min速度离心30min，去除上清液，即得荧光标记25-羟基维生素D抗体；用PBS溶液将所述荧光标记25-羟基维生素D抗体稀释10倍后，均匀地喷涂到偶合物结合垫片上，喷涂量为25μL/cm，于37℃温度下烘干即得包被有荧光标记25-羟基维生素D抗体的偶合物结合垫片。优选地，所述荧光微球为羧基荧光微球，所述活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；或者所述荧光微球为氨基微球，所述活化剂为N-羟基琥珀酰亚胺；或者所述活化剂为羟基微球，所述活化剂为BrCN。优选地，所述偶合物结合垫片按如下步骤制备：用pH值为6.4～6.6的MES溶液洗涤荧光微球，8000～15000r/min速度离心30min，去除上清液，重复操作两次；用pH值为8.5～9.5的硼酸溶液重悬荧光微球，加入25-羟基维生素D鼠单克隆抗体，室温下震荡混匀，8000～15000r/min速度离心30min，去除上清液；用质量分数为5％的BSA溶液重悬荧光微球，室温下震荡反应1h，8000～15000r/min速度离心30min，去除上清液；用pH值为8.5～9.5的硼酸溶液重悬荧光微球，8000～15000r/min速度离心30min，去除上清液，即得荧光标记25-羟基维生素D抗体；用PBS溶液将所述荧光标记25-羟基维生素D抗体稀释10倍后，均匀地喷涂到偶合物结合垫片上，喷涂量为25μL/cm，于37℃温度下烘干即得包被有荧光标记25-羟基维生素D抗体的偶合物结合垫片。优选地，所述荧光微球包括肼基微球、氯甲基微球中的任意一种或者其组合物。优选地，所述荧光微球与所述25-羟基维生素D鼠单克隆抗体的质量比为5:1。优选地，所述样本稀释液为含有2％DMSO、0.25％ANS的0.01mol/L磷酸盐缓冲液，所述样本稀释液的pH值为6.5～6.7。本专利技术还提出一种检测25-羟基维生素D的荧光层析试剂盒的定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：采集血样2～3ml，室温放置15min-120min，以3000r/min速度离心30min，吸取上清液至样本稀释液中混匀，即得待测样本；利用移液器准确吸取80μL待测样本，滴加在检测25-羟基维生素D的荧光层析试剂盒的样本垫片上；待测样本层析完全后，检测荧光试纸条的测试带信号值和控制带信号值，通过仪器结合定标卡信息计算待测样本的25-羟基维生素D浓度，定量判定其质量浓度。本专利技术提供了一种检测25-羟基维生素D的荧光层析试剂盒及其定量检测方法，其中，所述检测25-羟基维生素D的荧光层析试剂盒包括试纸壳和设于所述试纸壳内的试纸条，所述试纸条包括PVC衬板、硝酸纤维素膜、偶合物结合垫片、样本垫片及吸水垫片，所述PVC衬板上粘贴有硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜的一端粘贴有偶合物结合垫片，另一端粘贴有吸水垫片，所述偶合物结合垫片上粘贴有样本垫片；所述硝酸纤维素膜上设置有测试带和控制带，所述测试带内包被有鼠抗25-羟基维生素D抗体，所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测25‑羟基维生素D的荧光层析试剂盒，包括试纸壳和样本稀释液，所述试纸壳上设置有加样窗口和检测窗口，所述试纸壳内设有试纸条，其特征在于，所述试纸条包括PVC衬板、硝酸纤维素膜、偶合物结合垫片、样本垫片及吸水垫片，所述PVC衬板上粘贴有硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜的一端粘贴有偶合物结合垫片，另一端粘贴有吸水垫片，所述偶合物结合垫片上粘贴有样本垫片；所述硝酸纤维素膜上设置有测试带和控制带，所述测试带内包被有鼠抗25‑羟基维生素D抗体，所述控制带内包被有兔抗鼠抗体；所述偶合物结合垫片包被有荧光标记25‑羟基维生素D抗体；其中，所述样本垫片位于所述加样窗口处，所述测试带和所述控制带位于所述检测窗口处。

【技术特征摘要】
1.一种检测25-羟基维生素D的荧光层析试剂盒，包括试纸壳和样本稀释液，所述试纸壳上设置有加样窗口和检测窗口，所述试纸壳内设有试纸条，其特征在于，所述试纸条包括PVC衬板、硝酸纤维素膜、偶合物结合垫片、样本垫片及吸水垫片，所述PVC衬板上粘贴有硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜的一端粘贴有偶合物结合垫片，另一端粘贴有吸水垫片，所述偶合物结合垫片上粘贴有样本垫片；所述硝酸纤维素膜上设置有测试带和控制带，所述测试带内包被有鼠抗25-羟基维生素D抗体，所述控制带内包被有兔抗鼠抗体；所述偶合物结合垫片包被有荧光标记25-羟基维生素D抗体；其中，所述样本垫片位于所述加样窗口处，所述测试带和所述控制带位于所述检测窗口处。2.如权利要求1所述的检测25-羟基维生素D的荧光层析试剂盒，其特征在于，所述硝酸纤维素膜按如下步骤制备：分别将测试带抗体原液和控制带抗体原液在4℃下以6000～13000r/min速度离心60min，吸取两种上清液；将两种上清液分别装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分后，超滤浓缩后装瓶冷冻，得到测试带抗体和控制带抗体；用pH值为6.5～6.7的磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液分别稀释两种抗体，得到0.8mg/ml测试带包被液和0.8mg/ml控制带包被液；将所述测试带包被液和所述控制带包被液分别喷涂在硝酸纤维素膜对应的测试带和控制带位置，喷涂量为1μL/cm；再将包被好硝酸纤维素膜置于37℃温度下烘干。3.如权利要求2所述的检测25-羟基维生素D的荧光层析试剂盒，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液按重量计包括：Na2HPO40.263-0.376份，KH2PO41.000-1.109份，NaCl6份，KCl0.2份，蒸馏水1000份；所述Tris缓冲液按重量计包括：三羟甲基氨基甲烷4.6-5.5份，KH2PO42.0-3.0份，NaCl8份，KClO4份，牛血清白蛋白9份，蒸馏水1200份。4.如权利要求1所述的检测25-羟基维生素D的荧光层析试剂盒，其特征在于，所述偶合物结合垫片按如下步骤制备：用pH值为6.4～6.6的MES溶液洗涤荧光微球，8000～15000r/min速度离心30min，去除上清液，重复操作两次；用MES溶液重悬荧光微球，并加入活化剂，活化30min；用pH值为6.4～6.6的MES溶液洗涤活化的荧光微球，8000～15000r/min速度离心30min，去除上清液，重复操作两次；用pH值为8.5～9.5的硼酸溶液重悬活化的荧光微球，加入25-羟基维生素D鼠单克隆抗体，室温下震荡混匀，8000～15000r/min速度离心30min，去除上清液；用质量分数为5％的BSA溶液重悬活化的荧光微球，室温下震荡反应1h，8000～15000r/min速度离心30min，去除上清液；用pH值为8.5～9.5的硼酸溶液重悬活化的荧光...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏宣喜，赖华，朱华琳，邓晓侠，
申请(专利权)人：广东优尼德生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44