一种藻蓝蛋白的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种藻蓝蛋白的制备方法，以鲜藻为原料，首先提取粗滤液，鲜藻脱水后，加入缓冲液，混匀，然后置－２０℃～－１０℃冰冻，冻结后，取出置室温下融溶，冻融３－５次，用板框过滤；其次是超滤纯化，用截留分子量为十万道尔顿的超滤膜，经过微滤的粗提液使分子量在十万道尔顿以下各种物质，透过超滤膜而被清除；第三是静置－澄清纯化，经过超滤纯化的藻蓝蛋白的分部，除去分子量十万道尔顿以下小分子，同时进行浓缩，经浓缩的藻蓝蛋白分部在３－５℃保藏；第四是羟基磷灰石柱层析纯化。本发明专利技术方法简便，纯化和浓缩效率高，具有社会、环境和经济效益。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及食品、化工、环境保护领域，更具体涉及。近年来，有些湖泊由于严重的富营养化，导致蓝藻水华的大量滋生，这些蓝藻水华在解体过程中会加速富营养化，而且其中还可能含有产生毒素的蓝藻，它们产生多种损害人类肝脏的毒素严重威胁人们的健康。如昆明滇池是昆明地区唯一的饮水源，滇池蓝藻水华的年生物量达万吨级，相当可怕，必须除去，化害为利，化废为宝，把其中有利的藻蓝蛋白提出来，变成可食用的天然色素。经检索未见到一种藻蓝蛋白制备方法公开或使用。日本的一家化学品公司是世界上唯一大规模从事食用色素级藻蓝蛋白产品生产及经销的公司，它提取藻蓝蛋白的方法已申请专利保护，使用螺旋藻干粉添加缓冲溶液后，在20℃搅拌5小时。而有些文献中发表的方法，则完全局限于实验室规模，包括盐析、凝胶过滤，吸附色谱，离子交换色谱，以及其它更昂贵的方法，这些方法大多不适于制备食品色素级的产品。如盐析法在工业生产规模仅局限于某些酶(工业用酶)的生产。因为盐析一般使用硫酸铵，盐析所得到的蛋白中会污染上铵离子，然而即使很微量的铵离子都会影响食品的味道。再如凝胶过滤法，其一是凝胶过滤所用的各种凝胶都相当贵，除非生产价格昂贵的试剂级产品，否则因成本太高而无法承受；其二，目前大部分产品不耐压缩，因而不能制作成工业规模的粗柱。智利的Herrera A等(1989)提出了一种从螺旋藻粉大量制备藻蓝蛋白的工艺流程，先利用超滤技术进行纯化，再利用活性炭吸附杂质进一步纯化，然而其效率差，藻蓝蛋白的纯度以620nm处的光吸收与280nm的光吸收的比例(A620/A280)表示，粗提液为0.62，超滤处理后，只提高到0.72，纯度仅提高16％，再经过活性炭处理，纯度提高到0.77，这一工序纯度仅提高6.9％，效率差。本专利技术的目的是针对上述存在的问题，提供了一种既能纯化藻蓝蛋白，又能除去蓝藻水华中含有蓝藻藻毒素的制备方法，从而变环境污染物为可利用的资源。为了达到上述的目的，本专利技术采用以下技术措施采用螺旋藻鲜藻为原料，经过离心得脱水藻糊，加同等体积的磷酸缓冲液(PH6.8)，冻融3-5次，离心，弃去沉淀，收集上清，即为藻蓝蛋白粗提液，纯度为(A620/A280)为0.6左右。然后经过微滤预处理及超滤纯化处理，得到的藻蓝蛋白的纯度超过1.00，浓度提高7倍，色彩鲜艳，呈宝石蓝色，可直接分装成液态浓缩食用色素。经冷却干燥，获得固态藻蓝蛋白的食用色素，重溶性好。每100克干重的鲜藻，可提取4-10克藻蓝蛋白。其步骤是A、提取粗提液，采用冻融法处理鲜藻藻糊，在冷冻过程中，藻细胞周围的水先结冰，这种冰晶会刺破或挤压破藻细胞，从而使藻细胞内的藻蓝蛋白溶出。B、超滤工序(纯化、去毒)，化工行业使用一种超滤设备，在蛋白质化工中主要用于浓缩，对粗提液进行纯化。超滤设备的主要部件是超滤膜，制造商可以控制这种膜的孔径，使这种小孔只允许“小”的分子通过，“大”的分子则被截留。这样，“大”分子和“小”分子便分开了，得到了“小”分子组份和“大”分子组份，从而进行了纯化，而被截留的部分则同时被浓缩。使用截留孔径为10万道尔顿的超滤膜，可除去分子量小于10万道尔顿的各种分子，其中包括毒素，蓝藻毒素的分子量在1千左右，所以很容易除去，藻蓝蛋白则被截留，既被纯化，又除去了蓝藻毒素，且被浓缩，以便下道工序进行。C、静止-澄清纯化工序，经超滤工序后，分子量大于10万道尔顿的大分子被浓缩。在3-5℃静置时，一部分被浓缩的杂蛋白形成絮状沉淀，从溶液中析出。此时，只要经过离心，弃去沉淀，收集上清，便去除了这部分沉淀的杂蛋白，藻蓝蛋白的纯度使得以提高。D、羟基磷灰石层析工序(纯化)，羟基磷灰石层析工艺在化工行业被广泛地使用。原理是使用其对一些不同结构的分子吸附能力不同，然后用浓度不同的洗脱液，分步洗脱，一类物质在低浓度的洗脱液中被洗脱出来，而另一类物质在较高浓度的洗脱液中被洗脱出来。羟基磷灰石对别藻蓝蛋白吸附力较强，对藻蓝蛋白吸附力较弱，因而，在低浓度洗脱液洗脱时得到鲜艳的宝石蓝色的藻蓝蛋白分部分，在高浓度的洗脱液洗脱时，得到灰蓝色的别藻蓝蛋白分部。有些蓝藻水华中含别藻蓝素相当多，它掩盖了藻蓝蛋白的颜色，所以必须把它们分开，从而得到二种色泽有别的色素蛋白。实施例1、提取粗提液。取蓝藻鲜藻，经脱水后，加等体积的缓冲液(PH5.0-9.0)，混匀，然后置-20℃～-10℃冰冻，待冻结之后，取出置室温下使之融溶，冻融处理3-5次，绝大部分藻蓝蛋白被从细胞内提取出来，然后利用板框过滤或离心分离法，使粗提液与细胞碎片相分离。2、微滤、预处理。使用孔径为2-3μm和0.45-0.22μm的二种微滤单元，对藻蓝蛋白的粗提液进行微滤处理。然后进一步去除粗提物中的细胞膜碎片，避免它们堵塞超滤膜。同时经过0.22μm微滤膜滤过之后，可清除掉粗提物中的微生物，防止在以下加工过程中微生物的分解作用。3、超滤纯化工序。使用截留分子量为十万道尔顿的超滤膜设备，处理经过微滤处理的粗提液，分子量在十万道尔顿以下的各种物质，包括小分子量的杂蛋白，小分子的有机物，多肽，及其它无机小分子，如分子量1千左右的蓝藻毒素，均透过超滤膜而被清除，而藻蓝蛋白及其它分子量大于10万道尔顿的分子则滞留在超滤膜内。这样，藻蓝蛋白的纯度得以提高。蓝藻水华的干燥粉的粗提物为例，其纯度为0.39，经过超滤纯化后，纯度提高到1.00-1.20，提高到原来的256-308％。4、静置-澄清纯化工序。经过超滤纯化的藻蓝蛋白分部，由于除去了分子量十万道尔顿以下的小分子，所以，也同时进行了浓缩。这种经浓缩的藻蓝蛋白分部在3-5℃保藏2-3天后，便会出现一些絮状沉淀，这是淡黄色的，是杂蛋白形成的沉淀。只要经过离心或过滤处理，可以很容易地除掉这一部分杂蛋白，从而使产品纯度从1.0-1.20提高到1.40-1.50。5、羟基磷灰石柱层析纯化工序。在蓝藻水华的提取物中，除含有藻蓝蛋白外，还含有一种别藻蓝蛋白，别藻蓝蛋白呈灰蓝色，它掩盖了藻蓝蛋白鲜艳的宝石蓝色。采用实验室常用的羟基磷灰石柱层析法，使二种物质分开。将通过静置-澄清纯化工艺处理的材料上羟基磷灰石柱，使柱的1/3着染，然后用0.001-0.25M不同浓度的磷酸缓冲液分步洗脱，共分5个不同浓度洗脱，每步1个柱体积。先可得到色彩鲜艳的宝石蓝色分部，这就是藻蓝蛋白分部，在0.125-0.25M浓度的洗脱液洗脱时，灰蓝色蛋白的别藻蓝蛋白才洗脱下来。经过此工序，藻蓝蛋白分部的纯度可提高到1.6-2.0，至此，产品纯度远超过食用色素级的标准。本专利技术与现有技术相比，具有以下优点和效果方法简便，适应不同来源的蓝藻资源，变害为利，变废为宝，纯化效率和浓缩效率高，与国外同行相比，提高了十倍，投资小，成本低，具有社会、环境和经济效益。权利要求1.，其特征是A、提取粗滤液，鲜藻脱水后，加入缓冲液(PH5.0-9.0)，混匀，然后置-20℃～-10℃冰冻，冻结后，取出置室温下融溶，冻融3-5次，用板框过滤；B、超滤纯化，采用截留分子量为十万道尔顿的超滤膜，经过微滤的粗提液，使分子量在十万道尔顿以下各种物质，透过超滤膜而被清除；C、静置-澄清纯化，经过超滤纯化的藻蓝蛋白的分部，除去了分子量十万道尔顿以下的小分子，同时进行浓缩，经浓缩的藻蓝蛋白分部在本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种藻蓝蛋白的制备方法，其特征是：Ａ、提取粗滤液，鲜藻脱水后，加入缓冲液（ＰＨ５．０－９．０），混匀，然后置－２０℃～－１０℃冰冻，冻结后，取出置室温下融溶，冻融３－５次，用板框过滤；Ｂ、超滤纯化，采用截留分子量为十万道尔顿的超滤膜 ，经过微滤的粗提液，使分子量在十万道尔顿以下各种物质，透过超滤膜而被清除；Ｃ、静置－澄清纯化，经过超滤纯化的藻蓝蛋白的分部，除去了分子量十万道尔顿以下的小分子，同时进行浓缩，经浓缩的藻蓝蛋白分部在３－５℃保藏２－３天；Ｄ、羟基磷灰石 柱层析纯化，通过静置－澄清的材料上羟基磷灰石柱，使柱的１／３着染，用０．００１－０．２５Ｍ浓度的磷酸缓冲液分步洗脱。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：金传荫，刘永定，王高鸿，沈强，何家菀，宋立荣，
申请(专利权)人：中国科学院水生生物研究所，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]