一种检测芍药苷的试纸条及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供一种检测芍药苷的试纸条及其制备方法和应用，该试纸条包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和基板；其中，所述反应膜上具有包被有芍药苷半抗原‑载体蛋白偶联物的检测区和包被有羊抗鼠抗抗体的质控区，所述结合物释放垫上喷涂有芍药苷单克隆抗体‑胶体金复合物，本发明专利技术还提供一种应用上述试纸条检测样品中芍药苷的方法，本发明专利技术提供的试纸条和检测方法具有特异性强、灵敏度高、操作简便、可快速读取结果、成本低等特点，适合大量样品的筛查及中药现场质量监控。 1

Test strip for detecting paeoniflorin and preparation method and application thereof

The invention provides a test paper for the detection of paeoniflorin and its preparation method and application. The test paper includes a sample absorption pad, a combination release pad, a reaction film, a water absorbent pad, and a base plate, wherein the reaction film has a detection area containing a paeoniflorin half antigen carrier protein coupling and a clad of anti antibody against mice with a sheep. The invention also provides a method for detecting paeoniflorin in the sample by using the test paper strip to detect paeoniflorin. The test paper and detection method provided by the invention have high specificity, high sensitivity, easy operation, rapid reading results, and a rapid reading result. It is suitable for screening a large number of samples and monitoring the quality of Chinese herbal medicines. One

【技术实现步骤摘要】
一种检测芍药苷的试纸条及其制备方法和应用
本专利技术涉及一种检测试纸条，具体是一种用于检测芍药苷的免疫胶体金试纸条，其特别适用于中药材、饮片、中成药、保健品、食品、化妆品等中芍药苷含量的检测。
技术介绍
芍药苷(Paeoniflorin，PF)是一种单萜类糖苷化合物。研究表明，芍药苷具有抗自由基损伤、抑制细胞内钙超载和抗神经毒性等活性，同时具有降低血液黏度、抗血小板聚集、扩张血管、改善微循环、抗氧化、抗惊厥等多种生物学效应，并且毒副作用较小。中药白芍、中医良方四物汤、中药胶囊剂等含芍药制剂的质量控制、药代动力学、配伍机理等过程研究皆以该成分为研究对象，药典中规定芍药苷为评价白芍、赤芍质量的首选指标。目前，对于中药材芍药苷的含量测定主要采用高效液相色谱法、薄层扫描法、毛细管电泳法等，尤以高效液相色谱法最为常用。但是上述方法样品前处理过程复杂、仪器昂贵、检测成本高，不利于方法的普及和大量样本的检测。以简单快速为特点的免疫检测技术是近年来中药有效成分分析技术的新热点。对小分子中药活性成分采用单抗建立的免疫检测方法已经有报道，如现有技术中如(《芍药苷的单克隆抗体制备及其中药材的免疫法测定》邵幼岩，2008年)公开了芍药苷的单克隆抗体，从而建立以此为基础的酶联免疫测定方法，首先采用高碘酸钠法将芍药苷分别与人血清白蛋白或鸡卵清白蛋白结合形成偶联物芍药苷-人血清白蛋白，芍药苷-鸡卵清白蛋白。该现在技术中公开的单克隆抗体是由芍药苷直接与载体蛋白偶联后免疫动物得到的，其检测的灵敏度和便利性取决于单抗的特异性和检测方法的操作性。但芍药苷的特征结构容易受载体蛋白的局部微化学环境或空间位阻的干扰，影响机体免疫系统的识别，难以产生特异性抗体或产生的抗体效价较低。
技术实现思路
现有技术的灵敏度尚存在问题，而且检测方法的便利性需要解决。采用试纸检测的便利性显而易见，但需要灵敏度高的单抗，而现有单抗的特异性无法满足试纸检测的要求。为此，本专利技术对单抗的种类进行了筛选，找到一种经过改进的灵敏度和特异性极高的单抗，满足了制备试纸的条件。本专利技术对芍药苷小分子结构进行改造，然后再与载体蛋白偶联后免疫动物产生单克隆抗体，这样可以保证芍药苷的原有分子特征结构充分暴露在人工抗原的表面，使其能最大限度地被动物的免疫活性细胞所识别，从而刺激机体产生特异性免疫应答，产生对芍药苷具有高亲和力和高特异性的抗体。本专利技术还提供了一种检测芍药苷的免疫胶体金试纸条。本专利技术另一个专利技术目的是提供该试纸条的制备方法。本专利技术的另一个专利技术目的是提供该试纸条的应用。本专利技术是通过下述技术方案实现的：一种芍药苷半抗原，其分子结构式：所述芍药苷半抗原是由氧化芍药苷与(4-氨基-苯基)-乙醛反应得到。具体如下：取(4-氨基-苯基)-乙醛，加稀盐酸溶解，低温下搅拌，加亚硝酸钠，继续搅拌，滴加含有氧化芍药苷的乙醇溶液，低温搅拌；停止反应，旋蒸，除去乙醇，加水，氢氧化钠溶液调节pH值到7，加乙酸乙酯萃取，旋蒸蒸干，二氯甲烷/石油醚混合液重结晶，得到乙醛氧化芍药苷半抗原产物。本专利技术的一种检测芍药苷的试纸条，该试纸条包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和基板；其中，所述反应膜上具有包被有芍药苷半抗原-载体蛋白偶联物的检测区和包被有羊抗鼠抗抗体的质控区，所述结合物释放垫上喷涂有芍药苷单克隆抗体-胶体金复合物。所述芍药苷半抗原如上述分子结构式为：所述芍药苷半抗原-载体蛋白偶联物由芍药苷半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白或甲胎蛋白。所述羊抗鼠抗抗体是以鼠源抗体为免疫原对山羊进行免疫制备获得。所述芍药苷单克隆抗体是以芍药苷半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原对小鼠进行免疫所得杂交瘤细胞株分离得到，该杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC14281。(该细胞株已经保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为CGMCC14281，保藏日期2017年06月06日，分类命名：芍药苷半抗原-载体蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号)。本专利技术所述反应膜、吸水垫、结合物释放垫、样品吸收垫依次粘贴在基板上，其中吸水垫覆盖反应膜顶端1-2mm处，结合物释放垫覆盖反应膜底端1-2mm处，样品吸收垫覆盖结合物释放垫底部1/3-1/2部分，检测区和质控区间隔0.5-1cm。本专利技术所述检测区的检测限浓度100μg/L)所述基板为PVC基板或其他硬质不吸水的材料；所述结合物释放垫及样品吸收垫为玻璃纤维素膜或聚酯材料；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。本专利技术还提供了一种制备上述试纸条的方法，包括以下步骤：1)制备喷涂有芍药苷单克隆抗体-胶体金复合物的结合物释放垫；2)制备具有包被有芍药苷半抗原-载体蛋白偶联物的检测区和包被有羊抗鼠抗抗体的质控区的反应膜；3)将1)和2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和基板组装成试纸条。具体地说，步骤包括：1)将氧化芍药苷与(4-氨基-苯基)-乙醛反应，制备芍药苷半抗原；2)将芍药苷半抗原与载体蛋白偶联，制备芍药苷半抗原-载体蛋白偶联物；3)用芍药苷半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌芍药苷单克隆抗体的杂交瘤细胞株；4)提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；5)分别将芍药苷半抗原-载体蛋白偶联物和羊抗鼠抗抗体包被于反应膜的检测区(T线)和质控区(C线)，检测区和质控区间隔0.5-1cm；6)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；将制备的芍药苷单克隆抗体加入到制备的胶体金中，得到芍药苷单克隆抗体-胶体金复合物；7)将芍药苷单克隆抗体-胶体金复合物喷涂在结合物释放垫上，37℃烘1h后取出，置于干燥环境中保存备用；8)将样品吸收垫用含牛血清白蛋白、磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃下烘干2h；9)在基板上按顺序粘贴上反应膜、吸水垫、结合物释放垫、样品吸收垫，吸水垫覆盖反应膜顶端1-2mm处，结合物释放垫覆盖反应膜底端1-2mm处，样品吸收垫覆盖结合物释放垫底部1/3-1/2部分，最后切成4mm宽的小条。更具体地，包括如下步骤：1、芍药苷半抗原的合成取(4-氨基-苯基)-乙醛，加稀盐酸溶解，低温下搅拌，加亚硝酸钠，继续搅拌，滴加含有氧化芍药苷的乙醇溶液，低温搅拌；停止反应，旋蒸，除去乙醇，加水，氢氧化钠溶液调节pH值，加乙酸乙酯萃取，旋蒸蒸干，二氯甲烷/石油醚重结晶，得到乙醛氧化芍药苷半抗原产物；2、免疫原制备——芍药苷半抗原与牛血清白蛋白(BSA)偶联得到免疫原取乙醛氧化芍药苷半抗原，加乙醇溶解，得到A液；取BSA，加的碳酸盐缓冲液溶解，得到B液；将A液逐滴加到B液中，室温，避光搅拌过夜；停止反应，透析纯化，得到免疫原；包被原制备——芍药苷半抗原与卵清蛋白(OVA)偶联得到包被原取乙醛氧化芍药苷半抗原，加乙醇溶解，得到A液；取OVA，加碳酸盐缓冲液溶解，得到B液；将A液逐滴加到B液中，室温，避光搅拌过夜；停止反应，透析纯化，得到包被原；3、芍药苷单克隆抗体的制备(1)杂交瘤细胞的获得1)首次免疫：将芍药苷半抗原-BSA偶联物(免疫原)与等量的弗氏完全佐剂充分乳化，皮下注射6周龄的Balb/c小鼠，；2)加强免疫两次：从首次免疫开始，每两周加强免疫一次，用弗式不本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测芍药苷的试纸条，其特征在于，所述试纸条包括样品吸收垫、结合物释放

【技术特征摘要】
1.一种检测芍药苷的试纸条，其特征在于，所述试纸条包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和基板；其中，所述反应膜上具有包被有芍药苷半抗原-载体蛋白偶联物的检测区和包被有羊抗鼠抗抗体的质控区，所述结合物释放垫上喷涂有芍药苷单克隆抗体-胶体金复合物，其中所述芍药苷单克隆抗体是以芍药苷半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原对小鼠进行免疫所得杂交瘤细胞株分离得到，该杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC14281。2.根据权利要求1所述的检测芍药苷的试纸条，其特征在于，其中，所述芍药苷半抗原-载体蛋白偶联物由芍药苷半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为人血清白蛋白、卵清蛋白或甲胎蛋白，所述芍药苷半抗原，分子结构式为：3.根据权利要求1所述的检测芍药苷的试纸条，其特征在于，其中，所述羊抗鼠抗抗体是以鼠源抗体为免疫原对山羊进行免疫制备获得。4.根据权利要求1所述的检测芍药苷的试纸条，其特征在于，其中，所述反应膜、吸水垫、结合物释放垫、样品吸收垫依次粘贴在基板上，其中吸水垫覆盖反应膜顶端1-2mm处，结合物释放垫覆盖反应膜底端1-2mm处，样品吸收垫覆盖结合物释放垫底部1/3-1/2部分，检测区和质控区间隔0.5-1cm。5.根据权利要求1所述的检测芍药苷的试纸条，其特征在于，其中，所述检测区的检测限浓度100μg/L。6.根据权利要求1所述的检测芍药苷的试纸条，其特征在于，其中，所述基板为PVC基板或其他硬质不吸水的材料；所述结合物释放垫及样品吸收垫为玻璃纤维素膜或聚酯材料；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。7.权利要求1所述的检测甘草酸的试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将氧化芍药苷与(4-氨基-苯基)-乙醛反应，制备芍药苷半抗原；2)将芍药苷半抗原与载体蛋白偶联，制备芍药苷半抗原-载体蛋白偶联物；3)用芍药苷半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌芍药苷单克隆抗体的杂交瘤细胞株；4)提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；5)分别将芍药苷半抗原-载体蛋白偶联物和羊抗鼠抗抗体包被于反应膜的检测区(T线)和质控区(C线)，检测区和质控区间隔0.5-1cm；6)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；将制备的芍药苷单克隆抗体加入到制备的胶体金中，得到芍药苷单克隆抗体-胶体金复合物；7)将芍药苷单克隆抗体-胶体金复合物喷涂在结合物释放垫上，37℃烘1h后取出，置于干燥环境中保存备用；8)将样品吸收垫用含牛血清白蛋白、磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃下烘干2h；9)在基板上按顺序粘贴上反应膜、吸水垫、结合物释放垫、样品吸收垫，吸水垫覆盖反应膜顶端1-2mm处，结合物释放垫覆盖反应膜底端1-2mm处，样品吸收垫覆盖结合物释放垫底部1/3-1/2部分，最后切成4mm宽的小条。8.权利要求7所述的检测甘草酸的试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：A、芍药苷半抗原的合成取(4-氨基-苯基)-乙醛，加稀盐酸溶解，低温下搅拌，加亚硝酸钠，继续搅拌，滴加含有氧化芍药苷的乙醇溶液，低温搅拌；停止反应，旋蒸，除去乙醇，加水，氢氧化钠溶液调节pH值，加乙酸乙酯萃取，旋蒸蒸干，二氯甲烷/石油醚重结晶，得到乙醛氧化芍药苷半抗原产物；B、免疫原制备——芍药苷半抗原与牛血清白蛋白(BSA)偶联得到免疫原取乙醛氧化芍药苷半抗原，加乙醇溶解，得到A液；取BSA，加的碳酸盐缓冲液溶解，得到B液；将A液逐滴加到B液中，室温，避光搅拌过夜；停止反应，透析纯化，得到免疫原；包被原制备——芍药苷半抗原与卵清蛋白(OVA)偶联得到包被原取乙醛氧化芍药苷半抗原，加乙醇溶解，得到A液；取OVA，加碳酸盐缓冲液溶解，得到B液；将A液逐滴加到B液中，室温，避光搅拌过夜；停止反应，透析纯化，得到包被原；C、芍药苷单克隆抗体的制备(1)杂交瘤细胞的获得1)首次免疫：将芍药苷半抗原-BSA偶联物(免疫原)与等量的弗氏完全佐剂充分乳化，皮下注射6周龄的Balb/c小鼠；2)加强免疫两次：从首次免疫开始，每两周加强免疫一次，用弗式不完全佐剂代替弗氏完全佐剂，方法和剂量同首次免疫；3)最后一次加强免疫一周后眼底静脉采血测效价和抑制，处死小鼠，取其脾脏与骨髓瘤细胞融合；4)采用间接竞争酶联免疫分析方法测定细胞上清液，筛选阳性孔，利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，得到并建立稳定分泌芍药苷单克隆抗体的杂交...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯红，张兰兰，李细芬，凃媛，
申请(专利权)人：数字本草中医药检测有限公司，
类型：发明
国别省市：河北,13