一种β-激动剂半抗原和人工抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种β‑激动剂半抗原，其分子结构如下式（I）所示：

Beta agonist hapten and artificial antibody and preparation method and application thereof

The invention discloses a beta agonist hapten, whose molecular structure is as follows: (I):

【技术实现步骤摘要】
一种β-激动剂半抗原和人工抗体及其制备方法和应用
本专利技术涉及食品安全检测
，具体地，涉及一种β-激动剂半抗原和人工抗体及其制备方法和应用。
技术介绍
β-激动剂（β-agonist）是β-肾上腺素受体激动剂（β-adrenoceptoragonist）的简称，属于苯乙胺类药物的一种，β-激动剂从医学上分类归属于拟交感神经作用药，因其能够改变能量分配，降低脂肪生成，促进脂肪分解，促进蛋白质合成并减少其降解，上世纪80年代就有将β-激动剂添加到饲料中用以提高牛、羊、猪等牲畜的瘦肉生长率的相关报道。当人体累计摄入剂量超过阈值或食入高残留的动物内脏组织时，β-激动剂会产生明显的生理毒性，导致心悸、战栗、头晕目眩、恶心呕吐、血管舒张、神经过敏、心跳加速等症状，严重的甚至有可能导致死亡，因此世界各国已禁止将这类物质用于食品动物。然而，作为“瘦肉精”使用的β-激动剂却先后出现，例如克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、溴布特罗等药物被不法商家用于谋取利益。其中，沙丁胺醇具有手性结构，在生理情况下，左旋异构体能更好的与受体结合表现出生理活性，因此R-(-)-沙丁胺醇多作为临床治疗哮喘等呼吸系统疾病的药物。R-(-)-沙丁胺醇作为沙丁胺醇外消旋体的活性结构，应该作为重点监控检测的对象，在食品加工、贮藏和销售等环节加强此类药物的监控检测是十分必要的。但是目前尚未出现对β-激动剂手性结构以及广谱特异性的检测方法。目前，β-激动剂的检测方法主要有高效液相色谱（HPLC）、液相色谱-串联质谱（LC-MS或LC-MS/MS）、气相色谱（GC-MS）、毛细管电泳色谱（CE）等。这些方法虽然准确度高，但其仪器设备昂贵、样品前处理复杂繁琐、检测成本高且需要专业人员操作等，不能实现高通量快速检测的目的。而免疫检测方法具备快速、灵敏、准确、操作简便等特点，且对样品纯度要求不高，适用于大批量样品的现场快速检测。虽然目前多数检测β-激动剂的抗体均具有较高特异性，但却无法实现在同一实验中检测多种可能添加的β-激动剂。由于β-激动剂滥用的危害性较大，目前迫切需要能同时识别、检测多种β-激动剂的免疫检测方法，尤其是能够同时识别多种β-激动剂的抗体。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是针对现有技术中没有能同时识别多种β-激动剂的抗体，为了克服现有技术的上述不足，提供一种β-激动剂半抗原，以该半抗原与载体蛋白偶联制备的人工抗原为免疫原，制备的广谱特异性β-激动剂人工抗体，能同时检测多种β-激动剂类药物，可用于食品安全的现场快速检测。本专利技术的目的是提供一种β-激动剂半抗原。本专利技术的另一目的在于提供所述β-激动剂半抗原在制备β-激动剂人工抗原或抗体中的应用。本专利技术的另一目的在于提供所述β-激动剂半抗原的制备方法。本专利技术的另一目的在于提供一种β-激动剂人工抗原。本专利技术的另一目的在于提供所述β-激动剂人工抗原的制备方法。本专利技术的另一目的在于提供一种广谱特异性β-激动剂人工抗体。本专利技术的另一目的在于提供所述广谱特异性β-激动剂人工抗体在制备检测β-激动剂药物和/或其类似物的试剂盒中的应用。本专利技术的另一目的在于提供一种检测β-激动剂药物和/或其类似物的试剂盒。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下方案予以实现的：一种β-激动剂半抗原，其分子结构如下式（I）所示：。本专利技术请求保护所述β-激动剂半抗原在制备β-激动剂人工抗原或抗体中的应用。所述β-激动剂半抗原的制备方法，包括如下步骤：S1.将R-(-)-沙丁胺醇溶于甲醇中，充入氮气并加入琥珀酸酐，充分搅拌反应；S2.将S1所得反应产物离心并弃去上清，用无水乙醇洗涤沉淀物，经真空干燥后即得目标产物。优选地，S1中所述R-(-)-沙丁胺醇与甲醇的质量体积比为4～7mg/mL，所述R-(-)-沙丁胺醇与琥珀酸酐的物质的量比为1～1.5：1。更优选地，S1中所述R-(-)-沙丁胺醇与甲醇的质量体积比为5.5mg/mL，所述R-(-)-沙丁胺醇与琥珀酸酐的物质的量比为1.2：1。优选地，S1中所述搅拌反应的时间为6～15h。更优选地，S1中所述搅拌反应的时间为12h。本专利技术还请求保护一种β-激动剂人工抗原，是由上述β-激动剂半抗原与载体蛋白偶联得到。优选地，所述载体蛋白为牛血清白蛋白（BSA）或卵清蛋白（OVA）。所述β-激动剂人工抗原的制备方法，包括如下步骤：S1.将三乙胺溶于二甲基甲酰胺（DMF）溶液中，于4℃下搅拌10～20min，再加入β-激动剂半抗原和氯甲酸异丁酯，于4℃下搅拌反应15～60min，即得β-激动剂半抗原溶液；S2.将载体蛋白溶于碳酸盐缓冲液中，再边搅拌边逐滴加入S1所得β-激动剂半抗原溶液，于4℃下搅拌反应6～15h，反应结束后，于4℃下用PBS溶液透析，即得到β-激动剂人工抗原。上述制备方法为活泼酯法，优选地，所述制备方法为混合酸酐法。优选地，S1中所述搅拌反应的时间为30min，S2中所述搅拌反应的时间为12h。优选地，S2中所述PBS溶液的浓度为0.01mol/L，pH为7.4。本专利技术还请求保护一种广谱特异性β-激动剂人工抗体，是由上述β-激动剂人工抗原作为免疫原制备后，经辛酸-硫酸铵法纯化得到。作为一种优选的实施方案，所述广谱特异性β-激动剂人工抗体的制备方法，具体包括以下步骤：将上述β-激动剂人工抗原溶液与等量佐剂混合乳化，初次免疫与弗氏完全佐剂混合乳化后免疫，4周后使用免疫原与弗氏不完全佐剂乳化后加强免疫，每次加强免疫间隔3周，第三次免疫后第7天开始取血检测抗血清效价，直至抗血清效价不再增长，取血后采用室温自然凝固后分离抗血清，在4℃下放置过夜，离心取上层血清。采用辛酸-硫酸铵法纯化得到广谱特异性β-激动剂人工抗体。本专利技术还请求保护上述广谱特异性β-激动剂人工抗体在制备检测β-激动剂药物和/或其类似物的试剂盒中的应用。本专利技术还请求保护一种检测β-激动剂药物和/或其类似物的试剂盒，含有上述β-激动剂半抗原、上述β-激动剂人工抗原或上述广谱特异性β-激动剂人工抗体。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术提供了一种β-激动剂半抗原，以该半抗原与载体蛋白偶联制备的人工抗原为免疫原，制备的广谱特异性β-激动剂人工抗体灵敏度高，广谱特异性好，可以识别31种β-激动剂药物及其类似物。其中，对R-(-)-沙丁胺醇的半抑制浓度为0.5ng/mL，线性范围为0.11～40.86ng/mL，最低检测限为0.04ng/mL。该抗体能同时检测多种β-激动剂类药物，可用于食品安全的现场快速检测，具有广阔的应用前景。另外，本专利技术以R-(-)-沙丁胺醇为原料，经一步化学反应成功合成了β-激动剂半抗原。再将该半抗原与载体蛋白偶联制备人工抗原，经免疫后得到广谱特异性β-激动剂人工抗体。所述β-激动剂半抗原、人工抗原及人工抗体的制备方法简单，易于大规模生产应用。附图说明图1为实施例1中β-激动剂半抗原合成路线图。图2为实施例2中β-激动剂人工抗原的紫外扫描图谱；A为BSA，B为OVA。图3为实施例4中广谱特异性β-激动剂抗体对R-(-)-沙丁胺醇间接竞争ELISA的标准曲线。具体实施方式下面结合说明书附图及具体实施例对本专利技术作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。下述实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种β‑激动剂半抗原，其特征在于，其分子结构如下式（I）所示：

【技术特征摘要】
1.一种β-激动剂半抗原，其特征在于，其分子结构如下式（I）所示：。2.权利要求1所述β-激动剂半抗原在制备β-激动剂人工抗原或抗体中的应用。3.权利要求1所述β-激动剂半抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.将R-(-)-沙丁胺醇溶于甲醇中，充入氮气并加入琥珀酸酐，充分搅拌反应；S2.将S1所得反应产物离心并弃去上清，用无水乙醇洗涤沉淀物，经真空干燥后即得目标产物。4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，S1中所述R-(-)-沙丁胺醇与甲醇的质量体积比为4～7mg/mL，所述R-(-)-沙丁胺醇与琥珀酸酐的物质的量比为1～1.5：1。5.一种β-激动剂人工抗原，其特征在于，是由权利要求1所述β-激动剂半抗原与载体蛋白偶联得到。6.根据权利要求5所述β-激动剂人工抗原，其特征在于，所述载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白。7.权利要求5所述β-激动剂人工抗原的制...

【专利技术属性】
技术研发人员：雷红涛，姜文梦，王兰腾，沈兴，陈佳虹，孙远明，徐振林，李向梅，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44