低分子化的TPO激动剂抗体制造技术

本发明专利技术涉及改变的抗体，其包含单克隆抗体的至少二个Ｈ链Ｖ区以及至少二个Ｌ链Ｖ区，能够通过交联ＴＰＯ受体转导信号进入细胞，从而展示ＴＰＯ激动剂作用。该改变抗体能够用作ＴＰＯ信号转导激动剂，并因此用作血小板减少相关的血液病、癌症或白血病化疗后的血小板减少症等的预防和／或治疗药物。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及改变的抗体，其包含抗体的二个或多个H链V区以及二个或多个L链V区，该抗体通过交联TPO受体而显示激动剂活性。该改变的抗体具有通过交联TPO受体而转导信号进入细胞的TPO激动剂活性，并用作多种用途的药物。
技术介绍
血小板生成素(TPO)是1994年发现的一种血小板生成调节因子，已知由主要在肝中生成的分子量为70-80k的糖蛋白组成。血小板生成素是一种细胞因子，在骨髓中促进血小板前体细胞存活、增殖、分化和成熟，即促进巨核细胞分化和增殖。血小板生成素(TPO)受体早于TPO确认为一种调节血小板生成的特异性因子的受体，c-Mpl(M.Souyri等人，Cell 631137(1990))。据报告，c-Mpl主要分布于血小板前体细胞，巨核细胞和血小板细胞，抑制c-Mpl表达选择性抑制巨核细胞生成(M.Methia等人，Blood 821395(1993))。据报告，根据特异性针对c-Mpl配基的细胞的增殖分析以及利用c-Mpl纯化该配基的结果，c-Mpl的配基为TPO(F.deSauvage等人，Nature 369533(1994)；TD.Bartley等人，Cell771117(1994))。目前Mpl被称为TPO受体。因此，期望TPO和TPO受体激动剂作为血小板减少症的治疗药物，例如，作为减轻癌症病人骨髓抑制或骨髓切除治疗所致血小板减少症的药物。另一方面，通过降低分子大小改善对组织和肿瘤的通透性、并利用重组方法制备而开发改变的抗体，特别是分子大小下降的抗体，例如单链Fv。最近，单链Fv的二聚体，特别是双特异性二聚体已用于交联细胞。这种二聚体的典型例子是识别癌细胞抗原以及宿主细胞(如NK细胞和嗜中性白细胞)抗原的单链Fv的异源二聚体(Kipriyanov等人，Int.J.Cancer，77，9763-9772，1998)。它们利用将单链Fv构建为改变的抗体的技术而制备，通过诱导细胞间交联而更有效地治疗癌症。已经认为由抗体及其片段(例如Fab片段)，双特异性改变的抗体乃至单特异性的单链Fv二聚体诱导细胞间交联。对于能够通过交联细胞表面分子而转导信号的抗体，已知有细胞分化和增殖涉及的EPO受体的抗体(JP-A 2000-95800)、MuSK受体的抗体(Xie等人，Nature Biotech.15，768-771，1997)及其它。已知还存在TOP受体的激动剂抗体、其片段以及单链Fv(WO99/17364)。然而，尚无具有激动剂活性的单链Fv二聚体和改变的抗体，例如单链双价抗体的报告。注意到来源于单克隆抗体(本专利技术人制备的MABL-1抗体和MABL-2抗体)的单链Fv单体诱导含有IAP的细胞凋亡，不诱导细胞凋亡，而二聚体诱导凋亡，本专利技术人发现二聚体交联(二聚体化)细胞表面的IAP受体，从而转导信号进入细胞，导致诱导凋亡。这提示，单特异性单链Fv二聚体交联细胞表面分子(例如受体)，并像配基一样转导信号，从而用作激动剂。研究细胞间交联发现，上述单链Fv二聚体不引起血细胞凝集反应，而上述单克隆抗体则能。单链双价抗体(包含两个H链V区和两个L链V区的单链多肽)也观察到相同结果。这提示，单克隆抗体可能形成细胞间交联，而改变的抗体，如单链Fv二聚体和单链双价抗体，交联细胞表面分子但不形成细胞间交联。基于这些观察结果，本专利技术人新近发现，改变的抗体，例如单链Fv二聚体和单链双价抗体，除了已知的细胞间交联以外，交联相同细胞的细胞表面分子或细胞内分子，适合作为该分子的配基(特别是作为模拟天然配基作用的配基)。本专利技术人进一步发现，抗体分子(完全IgG)可以改变成为交联细胞表面分子的单链Fv二聚体、单链双价抗体等，从而降低细胞间交联引起的副作用，并提供了只诱导细胞目的效应的新药，完成了本专利技术。相比与该改变的抗体具有相同V区的完全抗体(IgG)，本专利技术改变的抗体具有显著高的活性。由于其分子大小比抗体分子下降，并缺少恒定区，其具有提高的组织通透性。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供低分子大小的激动剂改变的抗体，其包含单克隆抗体的二个或多个H链V区以及二个或多个L链V区，并通过交联TPO受体而具有TPO激动剂作用。因此，本专利技术涉及改变的抗体，其包含二个或多个H链V区以及二个或多个L链V区，优选每种2-6个，特别优选每种2-4个，最优选每种二个，并通过交联TPO受体而显示TPO激动剂活性。本说明书中“改变的抗体”是指包含二个或多个H链V区以及二个或多个L链V区的任何物质，其中所述V区直接连接或通过接头以共价键或非共价键连接。例如，通过肽接头或化学交联剂等连接抗体的各个V区而制备的多肽和化合物。本专利技术利用的二个或多个H链V区以及二个或多个L链V区可来源于相同抗体或不同抗体。本专利技术的改变的抗体可以是特异性识别并交联TPO受体、因而能够转导信号进入细胞的任何物质。它们包括进一步修饰该改变的抗体V区的部分氨基酸序列而制备的改变的抗体。本专利技术改变的抗体的优选实例为包含H链V区和L链V区的单链Fv的多聚体，例如二聚体、三聚体或四聚体，或者包含二个或多个H链V区以及二个或多个L链V区的单链多肽。如果本专利技术的改变的抗体是包含H链V区以及L链V区的单链Fv的多聚体，例如二聚体、三聚体或四聚体等，优选位于相同链上的H链V区和L链V区不结合形成抗原结合位点。更优选的实例为包含H链V区以及L链V区的单链Fv的二聚体、或者包含二个H链V区以及二个L链V区的单链多肽。改变的抗体的H链V区和L链V区优选通过接头相联。上述单链Fv多聚体包括非共价键多聚体、通过交联基的共价键多聚体以及通过交联剂的多聚体(抗体、抗体片段或双价改变的抗体)。用于交联肽的常规交联基可以用作形成多聚体的交联基。例如通过半胱氨酸残基交联的二硫化物，其它交联基，如C4-C10亚烃基(例如四亚甲基、五亚甲基、六亚甲基、七亚甲基以及八亚甲基等)或C4-C10亚烯基(顺/反-3-亚丁烯基、顺/反-2-亚戊烯基、顺/反-3-亚戊烯基、顺/反-3-亚己烯基等)。此外，能够结合单链Fv的交联剂有，例如可随意引入Fv的氨基酸序列，例如抗FLAG序列的抗体等或其片段、或来源于抗体的改变的抗体，例如单链Fv。本说明书″TPO激动剂作用″是指通过交联TPO受体而转导入信号的细胞内发生的生物学作用，例如增殖、分化或巨核细胞的生长刺激、或血小板生成。利用测定激动剂作用的已知方法，确定本专利技术TPO激动剂作用的ED50。测定的例子有，利用TPO敏感的细胞系(例如BaF/mpl或UT7/TPO)进行细胞增殖分析，测定MPL蛋白质的磷酸化，通过骨髓细胞分化进行巨核细胞集落分析，小鼠体内血小板恢复合成分析，利用人白血病成巨核细胞系(CMK)测定血小板抗原GPIIbIIIa(抗GPIIbIIIa)的表达诱导，或者测定成巨核细胞系(DAMI)的多倍性诱导。ED50为达到50％最大反应(剂量-反应曲线中设为100％)所需剂量。本专利技术优选的改变的抗体，其TPO激动剂作用(ED50)等于或好于具有与该改变的抗体相同的抗原结合区的抗体，即具有与形成该改变的抗体的抗原结合区的H链V区和L链V区对相同的H链V区和L链V区对的完全抗体(以下“亲本抗体”)，如IgG。更优选其TPO激动剂作用(ED50)高于亲本抗体二倍以上本文档来自技高网...

【技术保护点】
改变的抗体，其包含抗体的二个或多个Ｈ链Ｖ区以及二个或多个Ｌ链Ｖ区，并通过交联ＴＰＯ受体而显示激动剂活性。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：土屋政幸，大友俊彦，薮田尚弘，角田浩行，织田哲郎，
申请(专利权)人：中外制药株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]