本发明专利技术涉及一种基因治疗载体，包含显性抑制型(dominant negative)人类sterile apha and TIR motif‑containing 1(dnSARM1)、启动子、增加基因表达的β‑globin内含子、human growth hormone poly(A)tail序列等。本发明专利技术还涉及包含上述基因治疗载体的药物及组合。其优点表现在：本发明专利技术的基因治疗载体可用于治疗或预防由青光眼引起的视网膜神经节细胞病变。 1
Gene carrier and its gene therapy medicine for glaucoma treatment
The present invention relates to a vector for gene therapy, including the dominant inhibitory type (dominant negative), human sterile APHA and TIR motif containing APHA, promoter, gene expression beta globin intron, human growth globin. The invention also relates to drugs and combinations comprising the above gene therapy vectors. The advantages of the invention are as follows: the gene therapy carrier of the invention can be used to treat or prevent retinal ganglion cell lesions caused by glaucoma. One
【技术实现步骤摘要】
一种基因载体及其用于治疗青光眼的基因治疗药物
本专利技术涉及基因工程
，具体地说，是一种基因载体及其用于治疗青光眼的基因治疗药物。
技术介绍
青光眼(glaucoma)是一组以特征性视神经萎缩和视野缺损为共同特征的疾病，病理性眼压增高是其主要危险因素。目前已经认识到，青光眼属于一种神经变性性疾病，其病理特征是视网膜神经节细胞(retinalganglioncell,RGC)的凋亡及其轴突的变性，以及伴随而来的视功能进行性丧失。RGC负责向大脑输出由视网膜捕捉到的视觉信号，由于高眼压、多种遗传因素或神经退行性病变等引起的RGC持续变性或凋亡，可导致视神经乳头病变、视野缺失，进而发展为青光眼。青光眼病理机制复杂，有遗传和环境等因素参与，但其确切分子机制尚不明确。部分青光眼患者表现为高眼压，在临床可采取降眼压等对症治疗手段，但在长期无法逆转或延缓青光眼的发展。有研究发现，在青光眼动物模型病理早期阶段，视网膜出现代谢物烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamideadeninedinucleotide,NAD+)水平下降。NAD+是生化反应的重要介质，作为辅酶参与氧化还原反应，也可以作为底物参与分子信号传递。NAD+在细胞内合成与消耗之间的动态平衡将直接影响新陈代谢、生物昼夜节律，以及衰老等多种生物学过程。随年龄增长，体内NAD+水平下降，伴随线粒体结构和功能障碍，以NAD+作为辅底物的细胞信号传递酶活性受到影响，可能是NAD+失衡参与视网膜神经变性的主要机制。另有研究发现，通过补充NAD+或增强NAD+合成途径能延缓RGC病变，从而明确NAD+水平是引起RGC病变的触发因素。近年研究发现，在神经系统中，SARM1是促进NAD+水平下降的关键分子，而在疾病模型中通过抑制SARM1活性能有效保持NAD+水平和延缓神经元变性。结合生物技术的发展，基于腺相关病毒(adeno-associatedvirus，AAV)载体的针对眼部疾病的基因治疗方法受到广泛关注，其安全性和有效性得到初步验证和认可。因此，本专利技术结合AAV技术，开发一种特异靶向RGC并表达SARM1(DN)的基因治疗载体。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是，针对现有技术中的不足，提供一种基因载体。本专利技术的第二个目的是，提供一种药物组合物。本专利技术的第三个目的是，提供一种基因载体的应用。本专利技术的第四个目的是，提供一种治疗青光眼的方法。为实现上述第一个目的，本专利技术采取的技术方案是：一种腺相关病毒载体，所述的腺相关病毒载体含有增强子、特异性或非特异性启动子、表达SARM1(DN)蛋白的基因序列，SARM1(DN)蛋白的序列如SEQIDNO:2所示。优选地，表达SARM1(DN)蛋白的基因序列选自与SEQIDNO:1有至少96％、97％、98％、99％、100％同源性的核苷酸序列。更优选地，所述的SARM1(DN)的基因序列含有SEQIDNO:1。最优选地，所述的SARM1(DN)蛋白的核苷酸序列选自SEQIDNO:1。在上述任一优选例中，增强子为CMV，选自与SEQIDNO:4有至少95％同源性的核苷酸序列。更优选地，所述的CMV选自与SEQIDNO:4有至少96％、97％、98％、99％、100％同源性的核苷酸序列。最优选地，所述的CMV增强子的核苷酸序列选自SEQIDNO:4。在上述任一优选例中，腺相关病毒可以选自AAV1，AAV2，AAV3，AAV4，AAV5，AAV6，AAV7，AAV8，AAV9，AAV10，AAV2-AAV3，AAVrh.10，AAVhu.14，AAV3a/3b，AAVrh32.33，AAVHSC15，AAV-HSC17，AAVhu.37，AAVrh.8，CHt-P6，AAV2.5，AAV6.2，AAV2i8，AAV-HSC15/17，AAVM41，AAV9.45，AAV6(Y445F/Y731F)，AAV2.5T，AAV-HAE1/2，AAVclone32/83，AAVShH10，AAV2(Y->F)，AAV8(Y733F)，AAV2.15，AAV2.4，AAVM41，AAVr3.45AAV2或AAV5。最优选地，腺相关病毒选自AAV2。在上述任一优选例中，腺相关病毒为单链AAV。在上述任一优选例中，所述的腺相关病毒载体还含有一段缩短的嵌合内含子，所述的嵌合内含子序列选自与SEQIDNO:5有至少90％同源性的核苷酸序列。在上述任一优选例中，所述的腺相关病毒载体含有CMV增强子、SARM1(DN)的基因序列、β-globin内含子、hGHpA、L-ITR、R-ITR、Ampicillin、f1ori。在上述任一优选例中，表达SARM1(DN)蛋白的基因序列如SEQIDNO:1所示，L-ITR序列如SEQIDNO:3所示，CMV增强子序列SEQIDNO:4所示，β-globin内含子序列如SEQIDNO:5所示，hGHpA序列如SEQIDNO:7所示，R-ITR序列如SEQIDNO:8所示，Ampicillin序列如SEQIDNO:9所示，f1ori序列如SEQIDNO:11所示。在上述任一优选例中，所述的腺相关病毒载体序列含有SEQIDNO:10。为实现上述第二个目的，本专利技术采取的技术方案是：一种治疗青光眼的药物组合物，含有上述腺相关病毒载体和药学上可接受的载体，所述的药物组合物表达SARM1(DN)蛋白。为实现上述第三个目的，本专利技术采取的技术方案是：上述腺相关病毒载体在制备治疗青光眼的药物中的应用。为实现上述第四个目的，本专利技术采取的技术方案是：一种基因治疗青光眼的方法，将腺相关病毒载体眼内注射，移植SARM1活性。优选地，所述的眼内注射是指视网膜下腔注射或玻璃体腔注射。本专利技术优点在于：本专利技术的基因治疗载体用于治疗或预防由青光眼引起的视网膜神经节细胞病变。附图说明附图1：AAV_SARM1(DN)载体的质粒模式图。附图2：AAV_SARM1(DN)的质粒特征图。附图3：C57BL/6J小鼠玻璃体腔注射AAV_SARM1(DN)两周后视网膜铺片，免疫荧光染色图。附图4：C57BL/6J小鼠玻璃体腔注射AAV_SARM1(DN)或AAV-GFP，并同时在注射眼前方注射磁珠微粒造成青光眼，分别于2周、4周、8周后视网膜铺片，图示为其免疫荧光染色图。附图5：C57BL/6J小鼠玻璃体腔注射AAV_SARM1(DN)或AAV-GFP并同时在注射眼前方注射磁珠微粒造成青光眼，分别于2周、4周、8周后视网膜铺片，图示为其免疫荧光染色后进行RGC计数和存活率分析结果图。具体实施方式本专利技术人经过研究，提供一种腺相关病毒载体及其用于治疗青光眼的相关药物、药物组合物等。药物组合物及药盒为了便于临床应用，本专利技术的药物组合物可以包含在注射用给药器(如注射用针)中，所述的注射用给药器中，可以包含一次给药量的所述的药物组合物。所述的注射用给药器可以被包含在药盒中，以方便储存、使用。运输时需要将装有药物悬浊液的微小容器放置于干冰中。平时应保存于-80℃冰箱中。本专利技术所述的药盒或试剂盒中，还可包括使用说明书，以利于本领域技术人员按照正确的方式使用。如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性)的，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种腺相关病毒载体，其特征在于，所述的腺相关病毒载体含有增强子、特异性或非
【技术特征摘要】
1.一种腺相关病毒载体，其特征在于，所述的腺相关病毒载体含有增强子、特异性或非特异性启动子、表达SARM1(DN)蛋白的基因序列，SARM1(DN)蛋白的序列如SEQIDNO:2所示。2.根据权利要求1所述的腺相关病毒载体，其特征在于，表达SARM1(DN)蛋白的基因序列如SEQIDNO:1所示。3.根据权利要求1所述的腺相关病毒载体，其特征在于，所述的增强子增强子为CMV。4.根据权利要求1所述的腺相关病毒载体，其特征在于，所述的腺相关病毒为AAV2。5.根据权利要求1所述的腺相关病毒载体，其特征在于，所述的腺相关病毒为单链AAV。6.根据权利要求1所述的腺相关病毒载体，其特征在于，所述的腺相关病毒载体还含有一段缩短的嵌合内含子，所述的嵌合内含子序列选自与SEQIDNO:5有至少90％同源性的核苷酸序列。7.根据权利要求1所述的腺相关病毒载体，其特征在于，所述的腺相关病毒载体含有CMV...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙晓东，罗学廷，翟元琦，刘洋，
申请(专利权)人：上海市第一人民医院，
类型：发明
国别省市：上海,31
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