提高原代细胞中基于核酸内切酶的基因编辑制造技术

本文公开了基于核酸酶的基因组编辑系统以及使用该系统进行基因组编辑的方法。并且，本文公开了在存在辅助蛋白的情况下使用腺相关病毒(AAV)载体表达基于CRISPR/Cas9的基因组编辑所需的向导RNA时，在原代人类细胞中以最小的毒性提高Cas9介导的基因编辑效率的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】提高原代细胞中基于核酸内切酶的基因编辑优先权及相关申请的交叉引用本申请要求2015年5月13日提交的美国临时申请62/161,104的优先权，以引用的方式将其整体内容并入本文。序列表的引用本申请与电子格式的序列表一起提交。该序列表作为题为SCRI_094WO_SEQLIST.txt的文件而提供，大小为72,184字节，创建于2016年5月11日，最后一次修改于2016年5月11日。
本文提供的公开方面总体上涉及基于核酸内切酶的基因编辑系统和方法。本文提供的一些公开方面涉及CRISPR/Cas9基因编辑系统。
技术介绍
基于核酸内切酶的系统已经迅速成为生物医学研究中重要的基因编辑工具，在各种培养细胞和模式生物系统中证明了它们在基因破坏(genedisruption)和/或基因靶向方面的应用。用于基因编辑的基于核酸内切酶的系统允许科学家们以前所未有的精确度、效率和灵活性来编辑基因组。用于基因编辑的基于核酸内切酶的手段的实例包括含有(但不限于)锌指核酸酶(ZFN)、TAL效应子核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶(如MegaTAL)和CRISPR/Cas9的系统。
技术实现思路
本公开提供了在原代细胞中应用CRISPR/Cas9的几种方法，其中，用mRNA来表达Cas9，同时用mRNA来瞬时表达两种腺病毒蛋白(E4ORF6和E1B55K的突变形式H373A或H354)。野生型E4ORF6蛋白和E1B55K蛋白解除来自AAV载体的进入后表达缺陷，然而，如果使用野生型E1B55K蛋白或E4ORF6蛋白，则它们会使参与DNA修复的重要蛋白质复合物(称为MRN复合物)失效，导致由于缺乏DNA断裂的修复而产生细胞周期停滞和高毒性。利用不使MRN复合物失效的E1B55K突变体来替代野生型蛋白质的使用。Cas9与E4ORF6/E1B55K突变体的共表达导致在保持完整DNA修复的同时，充分解除对AAV表达的进入后限制。这允许当使用AAV载体来表达Cas9靶向所必需的向导RNA(guideRNA)时，以最小的毒性大幅地提高Cas9介导的基因编辑的效率。本文提供的系统的一些可选方式包含核酸内切酶，如此以提供在基因破坏中有用的额外工具。例如，几种可选方式涉及同时使用核酸内切酶的利用CRISPR/Cas9系统和方法来提高靶基因的失活效率的系统。更多可选方式涉及利用本文所述一个或多个系统的用于治疗、农业和/或其它商业上有用的目的的靶基因失活。进一步更多的可选方式涉及具有失活靶基因的自体原代细胞和/或非自体原代细胞的制备以及这些细胞在治疗和/或其它商业应用方面的用途。在一些可选方式中，提供了用于编辑细胞中至少一个靶基因的系统，所述系统包含：编码CRISPR向导RNA的第一核酸序列，其中所述CRISPR向导RNA与细胞中至少一个靶基因互补，并且，其中所述第一核酸序列存在于载体中；编码Cas9蛋白、其衍生物或其片段的第二核酸序列；编码第一腺病毒蛋白的第三核酸序列；以及编码第二腺病毒蛋白的第四核酸序列。在所述系统的一些可选方式中，所述细胞是真核细胞。在所述系统的一些可选方式中，所述细胞是哺乳动物细胞。在所述系统的一些可选方式中，所述细胞是人类细胞。在所述系统的一些可选方式中，所述细胞是原代细胞。在所述系统的一些可选方式中，所述细胞不是转化细胞(transformedcell)。在所述系统的一些可选方式中，所述细胞是原代淋巴细胞、CD34+干细胞、肝细胞、心肌细胞、神经元、神经胶质细胞、肌肉细胞或肠细胞。在所述系统的一些可选方式中，所述载体是病毒载体。在所述系统的一些可选方式中，所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。在所述系统的一些可选方式中，编码Cas9蛋白、其衍生物或其片段的所述第二核酸是mRNA。在所述系统的一些可选方式中，编码Cas9蛋白的所述第二核酸序列经密码子优化以在真核细胞(例如人类细胞)中表达。在所述系统的一些可选方式中，所述Cas9蛋白、其衍生物或其片段来自于酿脓链球菌(S.pyogenes)。在所述系统的一些可选方式中，编码第一腺病毒蛋白的所述第三核酸是mRNA。在所述系统的一些可选方式中，所述mRNA经密码子优化以在真核细胞(例如人类细胞)中表达。在所述系统的一些可选方式中，所述第一腺病毒蛋白是E4ORF6。在所述系统的一些可选方式中，编码第二腺病毒蛋白的所述第四核酸是mRNA。在所述系统的一些可选方式中，编码第二腺病毒蛋白的所述第四核酸经密码子优化以在真核细胞(例如人类细胞)中表达。在所述系统的一些可选方式中，所述第二腺病毒蛋白是E1B55K突变体。在所述系统的一些可选方式中，所述第一核酸序列、第二核酸序列、第三核酸序列和第四核酸序列连接至在真核细胞(例如人类细胞)中可操作的调控元件。在所述系统的一些可选方式中，将编码CRISPR向导RNA的所述第一核酸序列可操作地连接至调控元件。在所述系统的一些可选方式中，将编码CRISPR向导RNA的所述核酸序列可操作地连接至启动子(例如U6启动子)。在所述系统的一些可选方式中，编码CRISPR向导RNA的所述第一核酸序列是组成型表达的。在一些可选方式中，提供了编辑细胞中至少一个靶基因的方法，所述方法包括：将包含编码CRISPR向导RNA的第一核酸序列的第一载体导入细胞中，其中所述CRISPR向导RNA与所述细胞中至少一个靶基因互补；将编码Cas9蛋白、其衍生物或其片段的第二核酸序列导入所述细胞中；将编码第一腺病毒蛋白的第三核酸序列导入所述细胞中；以及将编码第二腺病毒蛋白的第四核酸序列导入所述细胞中。在所述方法的一些可选方式中，所述细胞是真核细胞。在所述方法的一些可选方式中，所述细胞是哺乳动物细胞。在所述方法的一些可选方式中，所述细胞是人类细胞。在所述方法的一些可选方式中，所述细胞是原代细胞。在所述方法的一些可选方式中，所述细胞不是转化细胞。在所述方法的一些可选方式中，所述细胞是原代淋巴细胞、CD34+干细胞、肝细胞、心肌细胞、神经元、神经胶质细胞、肌肉细胞或肠细胞。在所述方法的一些可选方式中，包含编码CRISPR向导RNA的第一核酸序列的所述第一载体是病毒载体。在所述方法的一些可选方式中，所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。在所述方法的一些可选方式中，所述第二核酸序列、第三核酸序列和第四核酸序列是mRNA。在所述方法的一些可选方式中，所述mRNA经密码子优化以在真核细胞(例如人类细胞)中表达。在所述方法的一些可选方式中，所述Cas9蛋白、其衍生物或其片段来自于酿脓链球菌。在所述方法的一些可选方式中，所述第一腺病毒蛋白是E4ORF6。在所述方法的一些可选方式中，所述第二腺病毒蛋白是E1B55K突变体。在所述方法的一些可选方式中，所述CRISPR向导RNA与目的靶基因互补。在所述方法的一些可选方式中，所述CRISPR向导RNA与目的靶基因互补。在所述方法的一些可选方式中，将所述第一核酸序列、第二核酸序列、第三核酸序列和第四核酸序列瞬时导入细胞中。在所述方法的一些可选方式中，所述第一核酸序列、第二核酸序列、第三核酸序列和第四核酸序列不是永久性地被导入细胞中。在所述方法的一些可选方式中，将所述第一核酸序列、第二核酸序列、第三核酸序列和第四核酸序列导入细胞不会转化细胞。在所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于编辑细胞中至少一个靶基因的系统，所述系统包含：编码一种或多种CRISPR向导RNA的第一核酸序列或核酸序列组，其中所述一种或多种CRISPR向导RNA与所述细胞中至少一个靶基因互补，并且，其中所述第一核酸序列或核酸序列组可包含在一个或多个载体中，但不是必需包含在一个或多个载体中；Cas9蛋白或编码Cas9蛋白的第二核酸序列；编码第一腺病毒蛋白的第三核酸序列；以及编码第二腺病毒蛋白的第四核酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.05.13 US 62/161,1041.用于编辑细胞中至少一个靶基因的系统，所述系统包含：编码一种或多种CRISPR向导RNA的第一核酸序列或核酸序列组，其中所述一种或多种CRISPR向导RNA与所述细胞中至少一个靶基因互补，并且，其中所述第一核酸序列或核酸序列组可包含在一个或多个载体中，但不是必需包含在一个或多个载体中；Cas9蛋白或编码Cas9蛋白的第二核酸序列；编码第一腺病毒蛋白的第三核酸序列；以及编码第二腺病毒蛋白的第四核酸序列。2.如权利要求1所述的系统，其中，所述细胞是真核细胞。3.如权利要求1-2中任一项所述的系统，其中，所述细胞是哺乳动物细胞。4.如权利要求1-3中任一项所述的系统，其中，所述细胞是人类细胞。5.如权利要求1-4中任一项所述的系统，其中，所述细胞是原代细胞。6.如权利要求1-5中任一项所述的系统，其中，所述细胞不是转化细胞。7.如权利要求1-6中任一项所述的系统，其中，所述细胞是原代淋巴细胞、CD34+干细胞、肝细胞、心肌细胞、神经元、神经胶质细胞、肌肉细胞或肠细胞。8.如权利要求1-7中任一项所述的系统，其中，所述载体是病毒载体。9.如权利要求8所述的系统，其中，所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。10.如权利要求8-9中任一项所述的系统，其中，所述AAV载体是自身互补载体。11.如权利要求8-9中任一项所述的系统，其中，所述AAV载体是单链载体。12.如权利要求8-9中任一项所述的系统，其中，所述AAV载体是自身互补载体和单链载体的组合。13.如权利要求1-12中任一项所述的系统，其中，编码Cas9蛋白的所述第二核酸是mRNA。14.如权利要求1-13中任一项所述的系统，其中，编码Cas9蛋白的所述第二核酸序列经密码子优化以在真核细胞(例如人类细胞)中表达。15.如权利要求1-14中任一项所述的系统，其中，所述Cas9蛋白来自于酿脓链球菌(S.pyogenes)。16.如权利要求1-15中任一项所述的系统，其中，编码第一腺病毒蛋白的所述第三核酸是mRNA。17.如权利要求1-16中任一项所述的系统，其中，编码第一腺病毒蛋白的所述第三核酸经密码子优化以在真核细胞(例如人类细胞)中表达。18.如权利要求1-17中任一项所述的系统，其中，所述第一腺病毒蛋白来自于血清型5的AAV。19.如权利要求1-18中任一项所述的系统，其中，所述第一腺病毒蛋白为野生型E4ORF6。20.如权利要求19所述的系统，其中，所述野生型E4ORF6的序列示于SEQIDNO：3中。21.如权利要求1-18中任一项所述的系统，其中，所述第一腺病毒蛋白为突变型E4ORF6。22.如权利要求1-17和21中任一项所述的系统，其中，所述突变型E4ORF6蛋白为AXA突变体。23.如权利要求22所述的系统，其中，所述AXA突变体的序列示于SEQIDNO：23中。24.如权利要求1-15中任一项所述的系统，其中，编码第二腺病毒蛋白的所述第四核酸是mRNA。25.如权利要求1-15和24中任一项所述的系统，其中，编码第二腺病毒蛋白的所述第四核酸经密码子优化以在真核细胞(例如人类细胞)中表达。26.如权利要求1-15和25中任一项所述的系统，其中，所述第二腺病毒蛋白来自于血清型5的AAV。27.如权利要求1-15和26中任一项所述的系统，其中，所述第二腺病毒蛋白为野生型E1B55K。28.如权利要求27所述的系统，其中，所述野生型E1B55K的序列示于SEQIDNO：1中。29.如权利要求1-15和26中任一项所述的系统，其中，所述第二腺病毒蛋白为突变型E1B55K。30.如权利要求29所述的系统，其中，所述突变型E1B55K为H373A突变体。31.如权利要求30所述的系统，其中，所述H373A突变体的序列示于SEQIDNO：2中。32.如权利要求29所述的系统，其中，所述突变型E1B55K为H354突变体。33.如权利要求32所述的系统，其中，所述H354突变体的序列示于SEQIDNO：4中。34.如权利要求29所述的系统，其中，所述突变型E1B55K为R240A突变体。35.如权利要求34所述的系统，其中，所述R240A突变体的序列示于SEQIDNO：22中。36.如权利要求1-35中任一项所述的系统，其中，所述第一核酸序列、第二核酸序列、第三核酸序列和第四核酸序列可操作地连接至在真核细胞(例如人类细胞)中可操作的调控元件。37.如权利要求1-36中任一项所述的系统，其中，编码一种或多种CRISPR向导RNA的所述第一核酸序列可操作地连接至调控元件。38.如权利要求1-37中任一项所述的系统，其中，编码一种或多种CRISPR向导RNA的所述第一核酸序列可操作地连接至U6启动子。39.如权利要求1-38中任一项所述的系统，其中，当所述第一核酸序列编码超过一种CRISPR向导RNA时，各向导RNA可操作地连接至各自的调控元件。40.如权利要求1-39中任一项所述的系统，其中，编码CRISPR向导RNA的所述第一核酸序列是组成型表达的。41.如权利要求1-39中任一项所述的系统，其中，编码CRISPR向导RNA的所述第一核酸序列是瞬时表达的。42.如权利要求1-41中任一项所述的系统，其中，针对TCRα基因的CRISPR向导RNA序列示于SEQIDNO：5、SEQIDNO：15、SEQIDNO：16和SEQIDNO：17中。43.如权利要求1-42中任一项所述的系统，其中，针对PD1基因的CRISPR向导RNA序列示于SEQIDNO：18中；针对TIGIT基因的CRISPR向导RNA序列示于SEQIDNO：19中；针对Lag3基因的CRISPR向导RNA序列示于SEQIDNO：20中；以及针对Tim3基因的CRISPR向导RNA序列示于SEQIDNO：21中。44.如权利要求1-43中任一项所述的系统，其中，所述系统可用于基因敲除、基因敲入或者两者皆可。45.如权利要求1所述的系统，其中所述第一核酸序列或核酸序列组以及所述Cas9蛋白或编码Cas9蛋白的所述第二核酸序列被第五核酸序列和第六核酸序列集体替代，其中所述第五核酸序列和所述第六核酸序列分别包含编码TALEN核酸酶的左侧元件和右侧元件的mRNA。46.用于编辑细胞中至少一个靶基因的方法，所述方法包括：将编码一种或多种CRISPR向导RNA的第一核酸序列或核酸序列组导入细胞中，其中所述一种或多种CRISPR向导RNA与所述细胞中至少一个靶基因互补；将Cas9蛋白或编码Cas9蛋白的第二核酸序列导入所述细胞中；将编码第一腺病毒蛋白的第三核酸序列导入所述细胞中；以及将编码第二腺病毒蛋白的第四核酸序列导入所述细胞中。...

【专利技术属性】
技术研发人员：安德鲁·沙尔博格，戴维德·罗林斯，迈克尔·C·延森，卡米拉·格威亚兹达，亚历山德拉·格里尔，
申请(专利权)人：西雅图儿童医院DBA西雅图儿童研究所，
类型：发明
国别省市：美国,US