一种CAV-1基因缺失斑马鱼及其制备方法技术

本发明专利技术提供一种CAV‑1基因缺失斑马鱼突变体及其制备方法，CAV‑1基因缺失斑马鱼突变体的构建是通过CRISPR/Cas9技术实现的。本发明专利技术的突变体模型可用于研究CAV‑1基因在肿瘤发生和远端转移过程中的作用。

A CAV-1 gene deletion zebrafish and its preparation method

The present invention provides a CAV deletion 1 gene deleted zebrafish mutant and its preparation method. The construction of a zebrafish mutant of the CAV 1 gene deletion zebra fish is realized by the CRISPR/Cas9 technique. The mutant model of this invention can be used to study the role of CAV 1 gene in tumorigenesis and distal metastasis.

【技术实现步骤摘要】
一种CAV-1基因缺失斑马鱼及其制备方法
本专利技术涉及分子生物学领域，涉及一种基因敲除的斑马鱼突变体，具体涉及CAV-1基因缺失斑马鱼突变体及其制备方法。
技术介绍
成簇规律间隔回文重复序列CRISPR(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalind-romicRepeats)和CRISPR相关核酸酶Cas(CRISPR-associatednuclease)系统是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御机制。该系统能够识别自身序列和外源入侵DNA片段，并剪切掉外源片段，从而达到保护自己的目的。科学家将这种免疫机制开发成为一种基因定点编辑技术，广泛应用于生物学和医学研究，目前最常见的基因编辑技术为CRISPR/Cas9系统。该系统通过向导RNA(singleguideRNA,sgRNA)序列，一方面特异识别靶序列，另一方面引导Cas9蛋白定点切割靶位点，使DNA靶位点形成双链缺口，细胞通过同源重组修复或者非同源性末端连接对断裂的DNA进行修复，从而实现基因的编辑。Caveolae结构细胞质膜向内凹陷所形成的囊泡状结构，参与细胞内外物质转运和细胞信号传导过程。微囊蛋白-1(Caveolin-1)是Caveolae结构的主要成分，对许多关键信号分子的活性状态起直接调节作用。有研究表明，Caveolin-1与肿瘤的发生与远处转移、癌细胞的转化等过程相关。CAV-1基因是编码Caveolin-1蛋白的DNA序列，可以通过对CAV-1基因进行定点编辑，从而研究Caveolin-1蛋白在肿瘤中的具体作用，以实现治疗疾病的目的。斑马鱼具有生长发育快，繁殖周期短、子代数量多、体外受精、胚胎透明等生物学特性，十分适合进行基因编辑。构建CAV-1基因突变斑马鱼作为疾病模型，能深入探究CAV-1基因与相关疾病的联系及发生机制，为靶向药物的筛选提供一种稳定可靠的模式生物。
技术实现思路
基于此，本专利技术的目的在于，提供一种CAV-1基因缺失斑马鱼及其制备方法。为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：一种CAV-1基因敲除方法，其过程包括，设计识别CAV-1基因靶位点的sgRNA序列，所述的sgRNA序列与核酸酶结合并引导核酸酶结合到CAV-1基因靶位点处，核酸酶对靶位点处的序列进行随机剪切，通过细胞自身的非同源末端连接修复机制修复CAV-1基因双链，造成移码突变，完成CAV-1基因被敲除。进一步地，所述的sgRNA序列具有序列表中SEQIDNO:1或SEQIDNO:2所示的核苷酸序列；所述的核酸酶为Cas9蛋白。进一步地，所述的SEQIDNO:1记载的核苷酸序列含有HaeⅡ酶切位点；所述的SEQIDNO:2记载的核苷酸序列含有StyⅠ酶切位点。本专利技术所述的CAV-1基因缺失斑马鱼突变体的制备方法，包括以下步骤：1)设计识别CAV-1基因靶位点的sgRNA序列，所述的sgRNA序列具有序列表中SEQIDNO:1或SEQIDNO:2所示的核苷酸序列；2)将所述的sgRNA序列和Cas9mRNA共同显微注射到斑马鱼胚胎中，然后对得到的斑马鱼胚胎进行培养，得到所述的CAV-1基因缺失斑马鱼突变体。进一步地，所述步骤1)具体包括：查询斑马鱼CAV-1基因序列及功能结构域，结合CRISPR/Cas9敲除原理，设计并合成包含sgRNA序列的引物序列，然后通过PCR扩增得到大量双链sgRNA序列，接着通过体外转录双链sgRNA序列得到单链sgRNA序列。进一步地，所述的引物序列具有序列表中SEQIDNO:3或者SEQIDNO:4所示的核苷酸序列，以及具有序列表中SEQIDNO:5所示的核苷酸序列。进一步地，步骤2)中，所述的Cas9mRNA来自于pGH-T7-zCas9质粒，XbaI酶切pGH-T7-zCas9质粒得到Cas9DNA双链，然后通过体外转录Cas9DNA双链得到Cas9mRNA单链。进一步地，步骤2)中，所述的斑马鱼胚胎为单细胞期胚胎，显微注射剂量为2nL；其中，sgRNA的注射浓度为300ng/μL，Cas9mRNA的注射浓度为120ng/μL。一种CAV-1基因缺失斑马鱼突变体的检测方法，包括以下步骤：以待检测的斑马鱼基因组DNA为模板，PCR扩增含有权利要求2中所述的sgRNA序列的DNA片段，然后HaeⅡ或者StyⅠ酶切该DNA片段，实现CAV-1基因缺失斑马鱼突变体的检测。进一步地，所述PCR扩增的引物序列具有序列表中SEQIDNO:6和SEQIDNO:7所示的核苷酸序列，或者具有序列表中SEQIDNO:8和SEQIDNO:9所示的核苷酸序列。本专利技术基于CAV-1基因与肿瘤的发生和远端转移、癌细胞的转化有关，构建了CAV-1基因缺失斑马鱼突变体，方便对CAV-1基因在疾病中的作用进行在体研究。附图说明图1为CAV-1突变体的繁育及筛选流程图；图2为XbaI酶切pGH-T7-zCas9质粒示意图；图3为显微注射和Cas9蛋白工作原理示意图；图4为显微注射胚胎CAV-1靶位点1酶切鉴定电泳图；图5为显微注射胚胎CAV-1靶位点2酶切鉴定电泳图；图6为F1的CAV-1靶位点1酶切鉴定电泳图；图7为F1的CAV-1靶位点2酶切鉴定电泳图；图8为qPCR检测F2突变体的CAV-1的mRNA表达水平柱状图。具体实施方式下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。实施例一：选择斑马鱼CAV-1基因靶位点查找斑马鱼CAV-1基因生物信息，基于CAV-1基因编码的蛋白Caveolin-1具有跨膜物质运输和信号传导作用，因此，将靶位点设置在CAV-1基因编码跨膜域的位置。同时，为了便于检测，靶位点序列中最好含有酶切位点。靶位点1位于Caveolin-1蛋白跨膜域5’端交界处，该序列中含有HaeⅡ酶切位点；靶位点2位于Caveolin-1蛋白跨膜域5’端前159碱基处，该序列中含有StyⅠ酶切位点。靶位点的核苷酸序列如下：靶位点1：ggctgctgacagcgctggt；(下划线部分为HaeⅡ酶切位点)靶位点2：gaccaggtcaatctccttggtg。(下划线部分为StyⅠ酶切位点)实施例二：筛选斑马鱼亲本单核苷酸多态性(Singlenucleotidepolymorphism,SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异而引起的DNA序列多态性，是自然界中的普遍现象。为了使sgRNA序列精确识别靶位点，需要筛选靶位点序列不存在SNP的胚胎，即需要筛选靶位点不存在SNP的斑马鱼亲本。本专利技术通过扩增包含靶位点序列的片段，对其测序，并比对其与靶位点序列的一致性，进行斑马鱼亲本的筛选。具体过程如下：选取6～8对AB品系野生型斑马鱼，剪背鳍，抽RNA并反转录得到cDNA，该cDNA作为PCR扩增模板。根据CAV-1基因靶位点处的序列，设计特异性引物，使得扩增得到的序列包含完整的靶位点序列，且只含有一个HaeⅡ或者StyⅠ酶切位点。引物如下：靶位点1的正向引物：aggtcttagaatccagtcagtg；反向引物：cactctgtccttacaccacc。靶位点2的正向引物：gtgtggtgcttcatttctatcc；反向引物：atggtcttactt本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种CAV‑1基因敲除方法，其特征在于，设计识别CAV‑1基因靶位点的sgRNA序列，所述的sgRNA序列与核酸酶结合并引导核酸酶结合到CAV‑1基因靶位点处，核酸酶对靶位点处的序列进行随机剪切，通过细胞自身的非同源末端连接修复机制修复CAV‑1基因双链，造成移码突变，完成CAV‑1基因被敲除。

【技术特征摘要】
1.一种CAV-1基因敲除方法，其特征在于，设计识别CAV-1基因靶位点的sgRNA序列，所述的sgRNA序列与核酸酶结合并引导核酸酶结合到CAV-1基因靶位点处，核酸酶对靶位点处的序列进行随机剪切，通过细胞自身的非同源末端连接修复机制修复CAV-1基因双链，造成移码突变，完成CAV-1基因被敲除。2.根据权利要求1所述的CAV-1基因敲除方法，其特征在于，所述的sgRNA序列具有序列表中SEQIDNO:1或SEQIDNO:2所示的核苷酸序列；所述的核酸酶为Cas9蛋白。3.根据权利要求2所述的CAV-1基因敲除方法，其特征在于，所述的SEQIDNO:1记载的核苷酸序列含有HaeⅡ酶切位点；所述的SEQIDNO:2记载的核苷酸序列含有StyⅠ酶切位点。4.一种CAV-1基因缺失斑马鱼突变体的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括以下步骤：1)设计并合成识别CAV-1基因靶位点的sgRNA序列，所述的sgRNA序列具有序列表中SEQIDNO:1或SEQIDNO:2所示的核苷酸序列；2)将所述的sgRNA序列和Cas9mRNA共同显微注射到斑马鱼胚胎中，然后对得到的斑马鱼胚胎进行培养，得到所述的CAV-1基因缺失斑马鱼突变体。5.根据权利要求4所述的CAV-1基因缺失斑马鱼突变体的制备方法，其特征在于，所述步骤1)具体包括：查询斑马鱼CAV-1基因序列及功能结构域，结合CRISPR/Cas9敲除原理，设计并合成包含sgRNA序列的引物序列，然后通过PCR扩增得到大量双链sg...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕志平，高磊，刘强，黄鹏，林海燕，周振婷，周楚莹，
申请(专利权)人：南方医科大学，
类型：发明
国别省市：广东,44