一种dead SaCas9-Fok1系统及其构建方法与应用技术方案

本发明专利技术公开了一种dead SaCas9‑Fok1系统及其构建方法与应用，由于SaCas9分子量小，p‑dead SaCas9‑Fok1重组质粒利用dead SaCas9替代传统的dead SpCas9，降低SpCas9空间位阻对Fok1相互结合的影响，从而提高其打靶效率；dead SaCas9‑Fok1系统需要配合2个21nt的Sa‑sgRNA共同作用，Sa‑sgRNA长于Sp‑sgRNA(20nt)，且SaCas9识别的PAM序列为6nt，长于SpCas9的PAM(3nt)，所以当dead SaCas9‑Fok1配合两个Sa‑sgRNA使用，进一步降低了脱靶效率。

A dead SaCas9-Fok1 system and its construction method and Application

The invention discloses a kind of dead SaCas9 Fok1 system and its construction method and application. As the SaCas9 molecular weight is small, the P dead SaCas9 Fok1 recombinant plasmid uses dead SaCas9 to replace the traditional dead SpCas9, and reduces the influence of the spatial bit resistance on the interaction of each other, thus raising the target efficiency. It is necessary to cooperate with the Sa sgRNA of 2 21nt, and the Sa sgRNA is longer than Sp sgRNA (20nt), and the PAM sequence identified by SaCas9 is 6nt and is longer than SpCas9, so it further reduces the miss distance efficiency.

【技术实现步骤摘要】
一种deadSaCas9-Fok1系统及其构建方法与应用
本专利技术涉及一种基因编辑系统，尤其是一种deadSaCas9-Fok1系统及其构建方法与应用。
技术介绍
CRISPR基因编辑技术已经广泛的应用于研究和生产中，是目前公认的第三代基因编辑技术(第一代，ZFN；第二代，TALEN；第三代，CRISPR)。相对于ZFN、TALEN等技术，CRISPR具有明显的优势，例如构建简单、效率高使用成本低。根据细菌来源不同，目前已经研发出不同类型的CRISPR酶系统，例如SpCas9、SaCas9、NmCas9以及StCas9系统等，但所有的CRISPR系统均包含以下几个部分，如图1所示：1)PAM位点，位于靶序列的下游，只有几个nt(例如，SpCas9/NGG；SaCas9/NNGRRT)，根据此位点来选取靶序列；2)sgRNA，识别并与切割位点结合的序列，一般在20nt左右；3)TracrRNA，连接于sgRNA之后的一段回文RNA序列；4)Cas9内切酶，含有2个独特的活性位点，分别为在氨基末端的RuvC和蛋白质中部的HNH。CRISPR-Cas9基因编辑系统的工作原理见图1所示，sgRNA、tracrRNA和Cas9组成复合体，识别并结合于sgRNA互补的序列，然后解开DNA双链，形成R-loop，使sgRNA与互补链杂交，另一条链保持游离的单链状态，然后由Cas9中的HNH活性位点剪切sgRNA的互补DNA链，RuvC活性位点剪切非互补链，最终引入DNA双链断裂(DSB)。CRISPR基因编辑具有以下特点：1、PAM序列一般只有几个nt，统计发现其在基因组中出现的频率很高，例如SpCas9/NGG在基因组中每35nt左右就会出现一次。2、sgRNA序列只有20nt左右，虽然使得我们在基因组中很容易选取靶向位点(针对相同长度的DNA序列，相对于ZFN、TALEN技术而言，CRISPR更容易选取到靶向位点)，但20nt左右的识别序列比较短，基因组中很容易出现相似的序列。综上原因，CRISPR在科研上更具有广泛的适用性。但站在应用的角度，CRISPR的缺点在于不仅可以切割靶向序列，同时也可能切割同源性较高的非靶向序列，即出现脱靶现象。此外还有研究发现，CRISPR能够在一定程度上忍受sgRNA与靶位点的错配，即靶向位点不需要完全与sgRNA序列配对，也可以被识别和切割，导致CRISPR可能出现更严重的脱靶现象。脱靶现象直接关系着CRISPR技术在临床使用上的安全风险，严重阻碍了该技术往临床应用方向的发展。现有技术中，为了降低CRISPR的脱靶效率，目前主要有以下几种途径：(1)选用PAM和sgRNA序列较长的CRISPR系统，例如SaCas9和NmCas9系统。(2)选用Nickase系统(SpNickase、SaNickase)。以SpNickase为例，该系统主要是将Cas9内切酶两个活性位点(RuvC、HNH)当中的一个失活，保留另外一个活性位点，然后选用两个sgRNA(一个结合正相序列，另外一个结合反相序列)配套使用，Nickase在每个sgRNA的识别位点都只切割一条DNA链，只要两个sgRNA的切割位点距离在一定范围内都能形成DSB。Nickase系统2个sgRNA的配合使用将原来20nt的识别序列增加到40nt，显著降低了其脱靶的可能性，具体工作原理如图2所示。(3)采用deadCas9融合Fok1系统。该系统同时失活Cas9内切酶的两个活性位点(RuvC、HNH)，从而形成了无内切酶活性的deadCas9蛋白，但deadCas9蛋白保留了与sgRNA结合的能力，从而仍然具有靶向结合DNA链的能力。在此基础上，deadCas9蛋白的C末端融合一个Fok1蛋白，只有当两个Fok1蛋白单体相互结合才能激活其核酸酶活力。这样的复合系统不仅延长了靶向序列，而且限制了两个sgRNA结合位点之间的距离，如果两个位点距离太远，Fok1就难以相互结合，从而不能发挥核酸酶活性。deadCas9-Fok1系统相比Nickase系统，进一步降低了脱靶的可能性，更具有临床应用的前景。然而上述现有技术仍然存在以下缺点：(1)SaCas9、NmCas9系统虽然PAM和sgRNA序列较长而脱靶频率较低，但改善的程度不大，达不到临床应用的要求，而且由于PAM序列增长，靶序列在基因组中出现的概率下降，从而导致靶位点选取困难。(2)Nickase系统目前常见的有SpNickase和SaNickase两种，虽然脱靶效率有明显下降，但是由于Nickase酶具有独立的单链切割活性，可以对靶向位点进行独立切割，仍可能存在非预期的脱靶突变，且Nickase系统对两个gRNA靶向序列之间的距离容忍性较大，研究发现两靶向序列之间间隔200bp左右仍能产生DSB，加之Cas9对sgRNA与靶序列错配的容忍性，使得Nickase系统的脱靶效率仍不能满足临床的需求。此外，由于Nickase系统对正义链和反义链切割所形成的缺口一般是错开的(即形成带粘性末端的DBS)，此缺口容易被细胞分别修复，从而导致产生DBS的几率下降，即切割效率降低。(3)deadCas9融合Fok1系统是目前普遍认为脱靶效率最低的一种CRISPR系统，主要通过两个sgRNA识别位点以及限制两个识别位点的距离来降低脱靶效率，但是目前只构建了deadSpCas9-Fok1系统，该系统是由SpCas9改造而来的，具体工作原理如图3所示。但是，SpCas9分子量很大，在空间结构上可能会阻碍两个Fok1单体的结合，从而降低切割效率，此外对于病毒运输载体而言，如此大的分子很难被包装和运输，从而限制了该技术的应用，尤其限制其在体内基因编辑的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种脱靶率低、切割率高、便于病毒载体运输的基因编辑系统，所述基因编辑系统在deadSaCas9的C末端融合一个Fok1蛋白，由于deadSaCas9分子量比较小，空间结构上对两个Fok1单体相互结合的影响比较小，从而不会影响Fok1的核酸酶活性，在保证低脱靶效率的同时，也能保证较高的切割效率。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种deadSaCas9-Fok1系统，包括deadSaCas9-Fok1和第一sgRNA和第二sgRNA；所述deadSaCas9-Fok1是在deadSaCas9的C端融合Fok1核酸酶后而得的，所述deadSaCas9是将SaCas9中的两个活性位点RuvC和HNH失活后而得的；所述第一sgRNA识别并结合的靶序列位于目的基因的一条链上，所述第二sgRNA识别并结合的靶序列位于目的基因的另一条链上；所述deadSaCas9-Fok1能够分别与第一sgRNA和第二sgRNA组成复合体，当所述第一sgRNA与deadSaCas9-Fok1组成的复合体和第二sgRNA与deadSaCas9-Fok1组成的复合体分别识别并结合到各自靶序列时，所述第一sgRNA与deadSaCas9-Fok1组成的复合体中的Fok1与所述第二sgRNA与deadSaCas9-Fok1组成的复合体中的Fok1能够相互结合，使得Fok1核酸酶活性被激活。本专利技术首先将SaCa本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种dead SaCas9‑ Fok1系统，其特征在于，包括dead SaCas9‑ Fok1和第一sgRNA和第二sgRNA；所述dead SaCas9‑ Fok1是在dead SaCas9的C端融合Fok1内切酶而得到，所述dead SaCas9是将SaCas9中的两个活性位点RuvC和HNH失活后而得到的；所述第一sgRNA识别并结合的靶序列位于目的基因的一条链上，所述第二sgRNA识别并结合的靶序列位于目的基因的另一条链上；所述dead SaCas9‑ Fok1能够分别与第一sgRNA和第二sgRNA组成复合体，当所述第一sgRNA与dead SaCas9‑ Fok1组成的复合体和第二sgRNA与dead SaCas9‑ Fok1组成的复合体结合到各自靶序列并相互识别时，所述第一sgRNA与dead SaCas9‑ Fok1复合体中的Fok1与所述第二sgRNA与dead SaCas9‑ Fok1复合体中的Fok1能够相互结合，使得Fok1内切酶活性被激活。

【技术特征摘要】
2016.12.13 CN 20161114441661.一种deadSaCas9-Fok1系统，其特征在于，包括deadSaCas9-Fok1和第一sgRNA和第二sgRNA；所述deadSaCas9-Fok1是在deadSaCas9的C端融合Fok1内切酶而得到，所述deadSaCas9是将SaCas9中的两个活性位点RuvC和HNH失活后而得到的；所述第一sgRNA识别并结合的靶序列位于目的基因的一条链上，所述第二sgRNA识别并结合的靶序列位于目的基因的另一条链上；所述deadSaCas9-Fok1能够分别与第一sgRNA和第二sgRNA组成复合体，当所述第一sgRNA与deadSaCas9-Fok1组成的复合体和第二sgRNA与deadSaCas9-Fok1组成的复合体结合到各自靶序列并相互识别时，所述第一sgRNA与deadSaCas9-Fok1复合体中的Fok1与所述第二sgRNA与deadSaCas9-Fok1复合体中的Fok1能够相互结合，使得Fok1内切酶活性被激活。2.如权利要求1所述的deadSaCas9-Fok1系统，其特征在于，所述deadSaCas9的脱氧核糖核苷酸序列为SEQIDNO：1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄雨亭，祝海宝，罗思施，陶米林，梁福才，刘方方，唐忆琳，
申请(专利权)人：广东赤萌医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44