本发明专利技术提供了靶向肿瘤坏死因子α（TNF‑α）疫苗制剂的蛋白抗原及其制备方法和用途。具体地，本发明专利技术的蛋白质抗原包括重组表达的hTNF‑α蛋白和CRM197，二者用戊二醛偶联，并用甲醛灭活。所述的蛋白抗原在疫苗剂量下几乎不具有TNF‑α毒性，但是在与氢氧化铝佐剂合用后，保留了强的免疫原性，能激发小鼠产生显著的针对人TNF‑α的免疫反应。
Chemical coupling product of TNF- alpha mutant protein and carrier protein CRM197 and preparation method thereof
The invention provides a protein antigen targeting tumor necrosis factor alpha (TNF alpha) vaccine preparation, and a preparation method and application thereof. Specifically, the protein antigen of the invention comprises recombinant expression of hTNF alpha protein and CRM197, and the two are conjugated with glutaraldehyde and inactivated with formaldehyde. The protein antigen described almost did not have TNF alpha toxicity at the dose of the vaccine, but after the combination with the aluminum hydroxide adjuvant, it retained a strong immunogenicity and could stimulate the mice to produce a significant immune response to human TNF alpha.
【技术实现步骤摘要】
TNF-α突变蛋白和载体蛋白CRM197化学偶联的产物及其制备方法
本专利技术属于生物和医药领域，具体地涉及低生物活性但具有强免疫原性的的肿瘤坏死因子α（TNF-α）疫苗的制法和用途。本专利技术制备到的抗原几乎不具有TNF-α毒性，但是在小鼠体内却具有强的免疫原性。
技术介绍
肿瘤坏死因子-α(TNF-α)作为一种重要的免疫调控分子，在细胞的生长、分化以及死亡等生理和病理过程中发挥重要的作用。TNF-α是一种主要由单核细胞或巨噬细胞产生的细胞因子，不仅能选择性地杀伤某些肿瘤细胞，而且有多种免疫调节功能。近年来研究发现，多种人类疾病和体内TNF-α的表达水平高有关，例如类风湿性关节炎等自身免疫性疾病和恶性肿瘤等。抑制TNF-α的功能已被证实可有效治疗上述疾病。事实上，在过去10年-15年中，美国FDA已批准5种TNF-α抑制剂，用于治疗包括类风湿性关节炎、银屑病、强直性脊柱炎、克罗恩病等自身免疫性疾病。这些抑制剂全部为单克隆抗体，包括Remicade、Humira、Simponi、Cimzia和Enbrel。这些药物是目前世界上最畅销的生物制剂。2014年，Humira、Remicade和Enbrel的销售额分别达到125.4亿美元、92.4亿美元和85.38亿美元。单克隆抗体药物具有一些缺点，包括用药剂量大（100mg），使用频繁（2-4次/月），费用昂贵，以及会产生抗药性抗体，因此在中国只有不到10%的患者能够长期使用。预防型疫苗是人类医疗史上最伟大的专利技术，在上个世纪挽救了上百万的生命。近年来针对针对自体蛋白的治疗型疫苗也迅速发展，到目前已有20多个针对高血脂、高血压、肥胖、自身免疫性疾病和肿瘤等慢性疾病的疫苗进入临床试验。与单克隆抗体相比，疫苗用药剂量少（100ug），使用不频繁（2-3次/年），费用相对较低以及不产生抗药性抗体。因此研发靶向TNF-α的疫苗被认为在保持抗体药物治疗疾病的效果的同时，可有效解决单克隆抗体药物的各种缺点。目前多种以TNF-α为靶点的疫苗已经进展到不同的阶段治疗。由于免疫耐受机制的存在，自体蛋白单独注射免疫并不能诱导产生抗体。为自体蛋白提供外源Th表位已被证实可有效帮助打破免疫耐受，赋予自体蛋白免疫原性。在mTNF-α分子中通过插入非天然的硝基酪氨酸从而引入外源的Th表位。结果证实该抗原可成功打破小鼠的免疫耐受，诱导产生针对mTNF-α的中和抗体。但是用该方法构建的抗原，TNF-α保留生物活性，因此免疫时会引起副作用。2006年LeBuanec等将hTNF-α通过戊二醛化学偶联到载体蛋白钥孔血蓝蛋白(keyholelimpetem℃yanin,KLH)上，通过甲醛可有效灭活TNF-α的活性。但是遗憾的是，该抗原在II期临床试验中并没能诱导产生的针对hTNF-α的中和抗体。因此开发新的针对TNF-α的疫苗具有重要意义，而这些疫苗的制备需要解决两个问题：（1）去除TNF-α的生物活性，降低抗原的毒副作用；（2）保留抗原的免疫原性，在体内能有效诱导产生中和TNF-α的抗体。CRM197（cross-reactingmaterials197）是白喉毒素丧失了毒性的一种突变体[J.Biol.Chem.1973.248:3838-3844.]，它是由野生型白喉毒素的碱基序列中由一个碱基G突变为A，从而导致了第52位氨基酸GLY突变为GLU[NucleicAcidsResearch.1984.Vol.12No.10,P4063-4070.]。从结构上看，CRM197具有完整的白喉毒素功能结构，但实验表明，白喉毒素的A片段能与NAD结合而CRM197不能，这表明NAD结合位点的变化影响了白喉毒素的酶活性及毒性。后来研究证明CRM197与白喉毒素的差异在于52位的GLY突变为GLU，这就证明了52位的GLY在白喉毒素NAD结合位点起着重要作用，这就导致白喉毒素酶活性位点——同NAD:EF2ADP核糖转移酶结合区发生改变，导致CRM197片段A不能EF2结合，不能对细胞起到毒性作用[ActapathmicrobiolimmunolscandsectC.1984,92:17-23.]。CRM197不具有酶活性以及毒性，但具有白喉毒素的免疫原性，因此CRM197也常被用作一种免疫蛋白载体交联其他抗原或半抗原一起作为疫苗。早在1985年美国科学家就利用CRM197的免疫原性，将嗜血流感菌表面的多糖交联到白喉毒素及CRM197的蛋白载体上制作疫苗防治呼吸道感染，从防治效果上看，两种交联疫苗在效果上没有显著差异，但是都能使小孩产生较强的免疫记忆[J.Clin.Invest.1985:52-59.]。美国科学家针对小儿在2岁前对于肺炎球菌疫苗（球菌表面多糖，PnPS）不能产生免疫记忆，因此将球菌表面七价多糖交联于多种蛋白载体以便在小儿2岁前能对肺炎球菌产生抗体，经过多种蛋白载体交联后的动物及临床效果比较，发现PnPS-CRM197能产生较好的免疫效果，而且安全无毒副作用[Pediatr.Infect.Dis.J.2000,19(3):187-195.]。目前该产品也通过美国FDA批准上市，商品名为Prevnar[BIOPHARMA:BiophamaceuticalProductsintheU.S.Market]。意大利科学家Francesco针对流行性脑膜炎也采用了利用其病菌表面多糖交联CRM197制作疫苗，他们从CRM197的结构上分析了交联的可行性，其中CRM197带有39个Lysin氨基酸残基和16个Arg残基，能提供较多的交联用的游离氨基。从实验结果来看，虽然化学交联率较高，但都没有达到理论交联率，而且，不同的糖其交联率也存在差异，这说明交联率也与交联物相关[BiophysicalJournal.2004,86(1Pt1):3-9.]。因此，本研究将hTNF-α偶联到CRM197突变体上，并检测该抗原在小鼠体内的免疫原性。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种含佐剂的抗TNF-α的蛋白质疫苗，包括TNF-α抗原、CRM197以及液体佐剂。具体的，人TNF-α是重组表达获得的重组蛋白，CRM197作为载体蛋白，液体佐剂是氢氧化铝佐剂。本专利技术的另一个目的是提供生产含佐剂的抗TNF-α的蛋白质疫苗的制备方法，步骤包括基因重组获得抗人TNF-α，用化学偶联剂将人TNF-α与细菌毒素化学偶联，对抗原灭活，最后添加液体佐剂。具体地，化学偶联剂是带有两个活性醛基的戊二醛，偶联的细菌毒素是用于制作白喉毒素疫苗的CRM197，其安全性是可靠的。本专利技术还有一个目的是提供一种增强抗TNF-α疫苗的免疫原性的方法，包括步骤：（1）采用TNF-α全蛋白，富含线性和非线性B细胞表位；（2）引入CRM197，作为载体蛋白，可有效递送抗原到MHC类分子上；（3）引入佐剂氢氧化铝，其是成熟的人体用佐剂，安全性是可靠的。本专利技术还提供这种含佐剂的抗TNF-α疫苗的用途。相比与现有技术，本专利技术将人TNF-α与完整的CRM197偶联，并对抗原进行灭活，最后添加安全的佐剂氢氧化铝。在不引起毒副作用的基础上，疫苗可诱发机体产生有效的免疫反应，从而为TNF-α相关疾病，包括类风湿性关节炎、克罗恩病、银屑病和强直性脊柱炎等提供治疗基础。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种含佐剂的抗TNF‑α的蛋白质疫苗，其特征在于，包括人TNF‑α、载体蛋白以及液体佐剂。
【技术特征摘要】
1.一种含佐剂的抗TNF-α的蛋白质疫苗，其特征在于，包括人TNF-α、载体蛋白以及液体佐剂。2.按照权利要求1所述的抗TNF-α的蛋白质疫苗，其特征在于：载体蛋白为CRM197。3.按照权利要求1或2所述的抗TNF-α的蛋白质疫苗，其特征在于：液体佐剂为氢氧化铝。4.按照权利要求1-3所述的抗TNF-α的蛋白质疫苗，其特征在于：化学偶联剂是带有两个活性醛基的戊二醛。5.按照权利要求1所述的抗TNF-α的蛋白质疫苗，其特征在于：既可单独使用也可与药物载体组合制成药物组合物。6.按照权利要求1所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：周福强，张丽，叶龙，仲从浩，程超，祝先潮，邓立，龚小海，颜远伟，黎荣松，徐爱章，张舒林，李荣秀，
申请(专利权)人：上海亨臻实业有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31
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