拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因AtSCPL30的启动子和其缺失突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因AtSCPL30的启动子和其缺失突变体，其中所述启动子命名为PD1，是位于拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因AtSCPL30翻译起始密码子ATG上游2093bp的调控序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述缺失突变体是将PD1的序列从5'端删除不同长度的片段后，获得的八段连续序列，顺序命名为PD2～PD9，其对应的核苷酸序列如SEQ ID No.2～SEQ ID No.9所示。本发明专利技术还公开了所述启动子及其缺失突变体在植物功能基因研究或在植物基因工程育种中的应用。实验证明PD1‑PD9能够启动下游基因(如GUS报告基因)在转基因植物受体各组织中高强度表达，且基本不受高盐、渗透胁迫、低温和低磷等逆境胁迫的诱导或抑制，是组成型强启动子，预示其应用价值巨大。

Promoter and deletion mutant of serine carboxypeptidase protein gene AtSCPL30 of Arabidopsis thaliana and its application

The invention discloses a promoter and a deletion mutant of the serine carboxypeptidase gene AtSCPL30 gene of Arabidopsis thaliana. The promoter is named PD1, which is a regulatory sequence of 2093bp in the upstream 2093bp of the AtSCPL30 translation initiation codon ATG of the Arabidopsis serine carboxypeptidase gene, and its nucleotide sequence, such as SEQ ID No.1, is shown by the nucleotide sequence. The missing mutant is a sequence of eight segments obtained from the deletion of different length fragments from the 5'end of the PD1 sequence. The sequence is named PD2 to PD9, and the corresponding nucleotide sequences, such as SEQ ID No.2 to SEQ ID ID No.9, are shown. The invention also discloses the application of the promoter and its deletion mutants in plant functional gene research or in plant genetic engineering breeding. The experiment shows that PD1 PD9 can initiate the high intensity expression of the downstream gene, such as GUS reporter gene, in the recipient tissues of transgenic plants, and is not induced or inhibited by the stress of high salt, osmotic stress, low temperature and low phosphorus. It is a strong promoter, which indicates the great value of its application.

【技术实现步骤摘要】
拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因AtSCPL30的启动子和其缺失突变体及其应用
本专利技术属于植物生物工程育种和分子生物学
，具体说，涉及一种拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因AtSCPL30的启动子序列和其缺失突变体及其应用。
技术介绍
自然条件下，植物经常遭遇不良环境,严重影响了作物的生长发育和产量。随着分子生物学和生物技术的迅速发展，已为作物新品种的培育提供了新思路、新方法和新资源。利用植物固有的生物学特性，发掘并克隆植物重要功能基因和调控元件，进行作物的分子设计与遗传改良，以提高作物对不良环境的适应性，是培育作物优良新品种的重要环节，也是保证粮食稳产、高产的有效措施(Khushetal.2010)。植物遭受逆境时会产生一系列的适应性改变，涉及众多基因的差异表达调控。基因的表达调控是一个非常复杂的过程，涉及多个层次，其中转录水平是基因表达调控的关键环节之一，通过基因5’上游的DNA调控序列与反式作用因子互作以实现目的基因的特定表达。目前，利用基因工程手段改良作物时，如何实现目标基因在受体组织中高水平稳定表达是研究的热点之一，也是制约基因工程发展的一个重要因素，而启动子在起始基因转录和调控基因表达效率方面发挥关键作用(Ahmadetal.2012)。选择合适的启动子构建植物表达载体，以驱动目的基因的高效表达是转基因成功的关键环节。近年来，随着分子生物学的迅速发展，越来越多的抗逆基因被克隆，与之相对的是可用于启动这些抗逆基因在植物受体中高效、稳定表达的启动子的数量及其种类非常有限。此外，人们对启动子上的顺式调控元件的种类和调控机理的了解也相对较少，限制了我们高效利用启动子调控目的基因。目前在作物遗传改良中能够被广泛使用的启动子非常有限，在单子叶植物中主要是玉米泛素(ubiquitin)基因启动子和水稻肌动蛋白(actin)基因启动子，在双子叶植物中主要是花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子(Yeetal.2012)。随着人们对转基因社会关注度和生物安全性要求的提高，病毒或者细菌来源的启动子也必将引起人们的高度关注，存在一定的安全隐患(Koiaetal.2013)。另外，病毒来源的CaMV35S启动子在作物育种中时常引发转基因沉默的发生(Elmayanetal.2003)。此外，作物的非生物胁迫适应性是非常复杂性，单个基因的导入可能不足以提高作物对自然环境的应对能力，多基因转化已成为必然趋势，然而在同一宿主体内用同一个启动子驱动多个基因的表达，可增加同源启动子的甲基化等，进而大大提高转基因沉默的发生概率(Metteetal.2000；Dongetal.2003)。然而，由于目前可用于作物遗传转化育种的启动子非常有限，在植物表达载体中利用CaMV35S启动子同时启动目的基因和筛选标记基因的表达非常常见，这将大大增加同源依赖性基因沈默的发生(Hanetal.2015；Kaietal.2005；Mccabeetal.1999)。分离植物来源的高效启动基因表达的组成型启动子不仅可实现目标基因在植物受体中高强度稳定表达，减少转基因沉默的概率，并且大大降低未来病毒来源的启动子带来的转基因安全隐患问题(Hernandez-Garciaetal.2009)。因此，发掘并鉴定植物来源的、高水平稳定启动基因表达的启动子已成为当务之急。丝氨酸羧肽酶(serinecarboxypeptidase,SCP)属于SC族羧肽酶中的S10家族，含有由丝氨酸、天冬氨酸和组氨酸形成的活性位点，分为羧肽酶I、II和III3种类型，是真核生物中广泛存在的一类蛋白水解酶。此外，在植物中存在一类与丝氨酸羧肽酶SCP的氨基酸序列高度同源的蛋白，称为丝氨酸羧肽酶类蛋白(serinecarboxypeptidase-likeproteins,SCPLs)。在高等植物中SCPLs大都与I和II型SCP蛋白的氨基酸序列高度同源，参与植物多种生物学过程，包括蛋白的水解、油菜素内酯的代谢、植物损伤应答等(Hauseetal.2002)。丝氨酸羧肽酶类蛋白SCPLs类型丰富，在水稻和拟南芥中分别预测到71个和54个编码SCPLs的基因，广泛分布在各条染色体上。目前已从多种植物中分离出SCP/SCPLs的编码基因，包括拟南芥、水稻、大麦、小麦、番茄、豌豆等。在高等植物中，SCP/SCPLs基因通常在各组织中广泛表达，仅有少部分基因具有组织特异性。Bienert等(2012)发现在烟草的根、茎、叶和花中均能够检测到NtSCP1和NtSCP2基因的表达。Liu等(2008)研究发现水稻丝氨酸类蛋白基因OsBISCPL1在叶片、根、茎及叶鞘中均表达，其中在叶片及叶鞘中的表达水平相对较高。SCP/SCPLs在植物生长发育及胁迫耐受性等方面均发挥重要作用。Li等(2011)研究发现GS5编码一个丝氨酸羧肽酶，过表达GS5可以使谷粒宽度和重量增加，产生更大的谷粒，相反GS5的功能缺失则导致谷粒显著减小。烟草和拟南芥中的研究表明SCP/SCPLs在调控心皮数和细胞伸长方面均发挥重要作用(Manuelaetal.2012；Wenetal.2012)。Wen等(2012)发现ECS1编码一个丝氨酸羧肽酶，在拟南芥中过表达ECS1导致其心皮数和种子数显著高于野生型，并且过表达植株的千粒重比野生型植株提高了约33％。在番茄中的研究表明，SCP酰基转移酶(SCPLa)参与葡萄糖聚酯的合成及昆虫的防御反应，在拟南芥中参与芥子酸胆酯的合成(Fraseretal.2007)。Zhou等(2005)发现拟南芥BRS1编码蛋白属于分泌型SCPII类蛋白，参与油菜素内酯(BR)信号传导过程，进而参与植物逆境胁迫响应等。刘丽等(2013)在烟草中过表达玉米ZmSCP，转基因植株的抗病性、抗氧化性以及耐盐性与野生型对照相比显著提高。总之，目前人们对SCP/SCPLs家族的部分蛋白的功能有了一定的了解，然而对其基因的表达调控机制研究很少。拟南芥AtSCPL30是丝氨酸羧肽酶类蛋白中的一员，Morcuende等(2007)通过AffymetrixATH1arrays分析发现该基因在拟南芥中具有非常高的表达水平，但迄今为止，未见该基因及其启动子克隆和应用的相关报道。基因的转录表达与启动子密切相关，克隆AtSCPL30的启动子序列并对其进行系统的功能分析，发掘其启动子核心功能区段或关键调控元件不仅可促进我们对SCP/SCPLs家族基因的表达调控机制的了解，而且对于启动子的改造和应用具有重要意义。
技术实现思路
针对目前的研究现状，本专利技术的目的是提供一种拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因AtSCPL30的启动子序列和其缺失突变体及其改造与应用。本专利技术所述的拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因AtSCPL30的启动子，命名为PD1，其核苷酸序列为以下序列之一：(1)来源于拟南芥的基因组，位于拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因AtSCPL30翻译起始密码子ATG上游2093个核苷酸组成的连续序列，该序列为SEQIDNo.1所示的核苷酸序列，与启动子克隆方法无关；(2)核苷酸序列与SEQIDNo.1互补的DNA；(3)在高严紧条件下能够与上述(1)或(2)DNA杂交且具有启动子功能的DNA；(4)对上述(1)或(2)所示DNA进行一本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因AtSCPL30的启动子，命名为PD1，其核苷酸序列为以下序列之一：(1)来源于拟南芥的基因组，位于拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因AtSCPL30翻译起始密码子ATG上游2093个核苷酸组成的连续序列，该序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，与启动子克隆方法无关；(2)核苷酸序列与SEQ ID No.1互补的DNA；(3)在高严紧条件下能够与上述(1)或(2)DNA杂交且具有启动子功能的DNA；(4)对上述(1)或(2)所示DNA进行一个或多个碱基的取代、缺失和/或添加且具有启动子功能的DNA；(5)与上述(1)或(2)所示DNA具有至少90％同源性且具有启动子功能的DNA；(6)采用缺失突变体构建、新的顺式作用元件的引入或利用PD1缺失突变体片段进行不同组合获得的核苷酸序列同源性≧60％且仍具有启动子功能的派生启动子。

【技术特征摘要】
1.一种拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因AtSCPL30的启动子，命名为PD1，其核苷酸序列为以下序列之一：(1)来源于拟南芥的基因组，位于拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因AtSCPL30翻译起始密码子ATG上游2093个核苷酸组成的连续序列，该序列为SEQIDNo.1所示的核苷酸序列，与启动子克隆方法无关；(2)核苷酸序列与SEQIDNo.1互补的DNA；(3)在高严紧条件下能够与上述(1)或(2)DNA杂交且具有启动子功能的DNA；(4)对上述(1)或(2)所示DNA进行一个或多个碱基的取代、缺失和/或添加且具有启动子功能的DNA；(5)与上述(1)或(2)所示DNA具有至少90％同源性且具有启动子功能的DNA；(6)采用缺失突变体构建、新的顺式作用元件的引入或利用PD1缺失突变体片段进行不同组合获得的核苷酸序列同源性≧60％且仍具有启动子功能的派生启动子。2.如权利要求1所述拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因AtSCPL30的启动子，其特征在于：所述启动子PD1的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。3.权利要求1所述拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因AtSCPL30启动子的缺失突变体，其特征在于：所述缺失突变体来源于拟南芥的基因组，是将启动子PD1的核苷酸序列从5'端删除不同长度的片段后，获得的剩余的连续核苷酸序列，共有独立的八段，其序列长度分别为1479bp、1135bp、874bp、731bp、601bp、456bp、294bp...

【专利技术属性】
技术研发人员：李坤朋，姜平平，张珂，亓守美，张可炜，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东,37