新的生色底物及其在测定羧肽酶活性中的应用制造技术

本发明专利技术涉及生色化合物及其在测定羧肽酶Ｎ和羧肽酶Ｕ族的酶中的应用。本发明专利技术更具体地涉及式（Ⅰ）化合物，式中Ａ＝（１）或（２）或（３）或（４）或（５），－Ｒ↓［１］，Ｒ↓［２］＝Ｈ，－ＣＨ↓［３］、－ＣＨ（ＣＨ↓［３］）↓［２］、－ＯＣＨ↓［３］、－Ｃｌ、－ＣＦ↓［３］、－ＯＣＦ↓［３］、－ＳＣＨ↓［３］，Ｒ↓［３］＝用羧肽酶Ａ可水解的氨基酸基，Ｒ↓［４］＝碱性氨基酸基。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生色化合物及其在测定羧肽酶N和羧肽酶U族酶中的应用。更具体地，本专利技术涉及所述化合物在测定血样的TAFI(凝血酶激活的纤维蛋白溶解抑制剂)活性中的应用与相应的测定方法。羧肽酶(CP)构成肽链端解酶族中的一组酶。它们是在最末COOH-端氨基酸处裂开多肽链酰胺键的酶。它们包括丝氨酸羧肽酶、半胱氨酸羧肽酶和金属羧肽酶。曾从细菌、酵母和植物中分离出许多羧肽酶，并且将其定序。这些酶还存在于各种的哺乳动物组织中。曾从胰腺和肥大细胞中分离出羧肽酶。还曾克隆、分离与定序过在血浆中循环的其它羧肽酶。所有这些酶在活体内都具有与它们的定位与物理性质同时相关的作用。因此，羧肽酶根据其底物特异性分为不同的类。羧肽酶A具有较宽的谱如果氨基酸是疏水的(Phe，Leu，Val，Ala)，它们优先水解最末端氨基酸的C-端肽键。它们水解二羧基氨基酸(Asp，Glu)以及甘氨酸(Gly)比较缓慢，完全不水解碱性氨基酸，例如精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)、组氨酸(His)或鸟氨酸(Orn)、赖氨酸的低级同系物，也不水解仲氨基酸，例如脯氨酸(Pro)或羟基脯氨酸(Hyp)。羧肽酶B特异性地水解最末C-端碱性氨基酸，例如Arg、Lys。这类酶可再分成由羧肽酶H(也称之脑啡肽转化酶(enlephalincovertase)或羧肽酶E)、M、N和U构成的亚类。羧肽酶E位于胰岛分泌粒子、肾上腺、脑下腺和脑中。羧肽酶M是一种存在于许多培养组织和细胞中的膜酶。羧肽酶N(下面有时表示为CPN)是一种在血浆中循环的酶。它可防止器官受到含有C-端碱性氨基酸(优选赖氨酸)的肽的血管活性和炎性作用，这些肽是在循环中释放的。这种酶在血液中以活性形式存在。它还因其自然底物而被称为激肽酶，这些底物是舒缓激肽、激肽、过敏毒素。最后，羧肽酶U(不稳定的)(下面有时表示为CPU)是也可水解C-端碱性氨基酸，优选精氨酸的酶，但与羧肽酶N相反，它们以活性形式存在时是非常不稳定的。BOUMA等人(1)发表了有关羧肽酶族酶的最新综述。TAFI是一种碱性锌金属羧肽酶(1-4)。更确切地说，它是一种羧肽酶U，因为在37℃下它的活性是不稳定的。例如在专利US5 206 161中描述了在人体中的这种酶(包括其cDNA)和相应的氨基酸序列，这种酶是一种血浆蛋白质，通过在活体外观察到在激活TAFI存在下延缓凝块溶解的现象，最初预料到所述蛋白质在调节纤维蛋白溶解中的作用。激活的TAFI分裂在血纤维蛋白COOH-端位所暴露的精氨酸和赖氨酸残基。这种水解导致在血纤维蛋白凝块表面血纤维蛋白溶酶原和tPA结合部位数的降低，从而导致tPA将血纤维蛋白溶酶原转化成血纤维蛋白溶酶的降低。由于在精氨酸残基上的羧肽酶活性，TAFI被成功地确认为羧肽酶原B(pro-PCPB)，进而是不稳定的羧肽酶原(pro-CPU不稳定的羧肽酶原)和羧肽酶原R(CPR)。该酶原形式是一种在肝脏中合成的并在血浆中循环的60kDa单链糖蛋白。该酶原主要在位arg 92处由凝血酶分裂。这种蛋白水解作用释放出一种含多个糖基化部位的92氨基酸N-端肽。在二价离子存在下凝血调节蛋白可显著增强凝血酶对TAFI的催化作用。凝血酶催化的TAFI激活速度因与凝血调节蛋白生成三元络合物而要快1000倍以上。激活的TAFI(TAFIa)由酶原C-端催化功能区构成，含有309个氨基酸。由于它在调节纤维蛋白溶解过程的机制中的关键作用，很快就证明，能够测量不同病理条件下血浆中的构成激活TAFI和可激活TAFI的量是很有用的。在现有技术中曾描述过几种使用特定底物测定各种羧肽酶活性的方法。WOLFF等人(5)通过测量UV吸收差，比较了合成底物Hip-Arg、Hip-Lys、Hip-Orn对于采用色谱法提纯的胰腺羧肽酶B的性能。在1970年，S.SUZUKI等人(6)改进了通过衍生由TT试剂(2，4，6-三氯-5-三嗪)释放的苯甲酰甘氨酸来检测水解产物的方法。这种衍生作用专门针对在唯一的游离酸基的α位上的甘氨酸的CH2进行。这种衍生物变成亮黄色(最大波长为382nm)。后来许多作者都广泛地采用这种使马尿酰残基显黄色的方法。在1972年，K.LORENTZ等人(7)使用对-苯醌作为试剂，利用了由羧肽酶B对底物Hip-Arg的作用所释放的精氨酸的显色反应。这样，显色衍生物的最大波长为480nm。在1980年，Th.H.Plummer等人(8)使用了合成底物呋喃基丙烯酰-丙氨酸-赖氨酸，用于确定羧肽酶N的量，在324nm读数(近UV，但不是可见光)。在1985年，G.H.Fischer等人(9)通过待测定羧肽酶的特定肽的N-端丹磺酰基化作用使用了荧光底物。这种测定需要在读数前有一个良好分离各组分的提取水解产物的步骤。在1986年，H.SARUTA等人采用比色法测定了羧肽酶A的活性(10)。这种方法使用一种特定的酶“马尿酸酶”，用以水解马尿酸基(hippuricyl)衍生物本身，而马尿酸基衍生物是使用CPA水解羟基-马尿酸基-Phg底物得到的。这个反应最后用4-氨基安替比林显色，得到在505nm吸收的醌亚胺染色剂。在1998年，NAM JOO HONG等人使用带有精氨酸类似物，即硫代精氨酸的合成底物测定CPB(11)。不过，上述比色方法或者从未用于专门测定CPN或CPU，特别是TAFI的酶活性，或者具有与采用比色法简单有效测定这类酶的试验不相容的某些缺陷。事实上，根据所考虑的情况-或者得到有色产物的衍生反应不是专门针对水解时释放的物质的，-或者衍生反应物毒性很强，因此不可能得到工业规模应用，-或者显色方法时间太长，是受限制的，不容易自动化。在1996年，W.L.Mock等人描述了一种通过使用在酶水解作用下脱色的合成底物来测定细菌源的细胞外锌内切蛋白酶，嗜热菌蛋白酶的测定方法(12)。为此，这些作者合成了二肽化合物，这些化合物由一种亮氨酸残基和其它一个中性氨基酸(Leu、Ala、Phe或Gly)构成，该亮氨酸残基在胺基处有接枝的N-(4-甲氧基苯基偶氮甲酰基)基团。引入芳基偶氮甲酰基(arazoformyl)基团得到高度着色的化合物。在嗜热菌蛋白酶存在下，该染色剂分子按照在(12-13)中充分描述的机理在水解化学反应期间发生重排，产生无色产物(茴香醚片段、N2、CO2和氨基酸)。因此，可以很容易地通过介质脱色速度跟踪酶速率。同样这些作者还描述了一种采用分光光度计测定的动力学方法，该方法的原理与前面的羧肽酶A(13)和猪胰腺羧肽酶B(14)的原理相同。在这种情况下，使用的化合物是由已知可由羧肽酶A切断的单一氨基酸(Phe，Leu)或可由羧肽酶B切断的唯一的氨基酸(Lys)构成的，它带有N-芳基偶氮甲酰基团。通过测量介质显色减弱可跟踪这些化合物酶分裂成无色产物。通过借鉴这些信息，本专利技术的专利技术人合成出新的显色化合物，这些化合物可用于用比色法测定羧肽酶N或羧肽酶U的活性，更特别地TAFI的活性。根据第一个方面，本专利技术涉及新化合物，它们构成羧肽酶N或羧肽酶U的底物，更特别地构成激活TAFI的底物。这些化合物是生色底物。本专利技术化合物的特征在于，它们是下述通式(I)的芳基偶氮甲酰基化合物 式中 或 或 或 或 -R1，R2＝H，-CH3、-CH(CH3)本文档来自技高网...

【技术保护点】
下式（Ⅰ）的化合物：　　　　＊＊＊　　　　式中：　　　　Ａ＝＊＊＊或＊＊＊或＊＊＊或＊＊＊或＊＊＊　　　　.Ｒ↓［１］，Ｒ↓［２］＝Ｈ，－ＣＨ↓［３］、－ＣＨ（ＣＨ↓［３］）↓［２］、－ＯＣＨ↓［３］、－Ｃｌ、－ＣＦ↓［３］、－ＯＣＦ↓［３］、－ＳＣＨ↓［３］；　　　　.Ｒ↓［３］＝用羧肽酶Ａ可水解的氨基酸基；　　　　.Ｒ↓［４］＝碱性氨基酸基。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：G昆廷，
申请(专利权)人：斯塔戈诊断公司，
类型：发明
国别省市：FR[法国]