具备转酯功能和耐酸抗蛋白酶特性的猪胰腺羧肽酶A1制造技术

本发明专利技术涉及一种具备转酯功能和耐酸抗蛋白酶特性的猪胰腺羧肽酶A1，其特征在于：其氨基酸序列如序列1所示。本发明专利技术提供的猪胰腺羧肽酶A1(CPA1)以酪蛋白和橄榄油为底物时，比活力分别为53.14U/mg和22.4U/mg，同时具备蛋白酶活性和转酯活性。本发明专利技术提供的猪胰腺羧肽酶CPA1经过pH 2.0酸性环境和胰蛋白酶处理后，其酶活残留率分别为95.65％和78.14％，能够抵抗强酸环境和胰蛋白酶的降解，将CPA1添加在饲料中，可进一步加快畜禽对营养物质的吸收。

【技术实现步骤摘要】
具备转酯功能和耐酸抗蛋白酶特性的猪胰腺羧肽酶A1
本专利技术属于生物
，涉及一种CPA1既能水解蛋白质，也能分解油脂，尤其是一种具备转酯功能和耐酸抗蛋白酶特性的猪胰腺羧肽酶A1。
技术介绍
畜禽幼崽因生理发育尚未成熟，消化能力较弱，分解吸收饲料中营养成分能力较低，因此畜禽的生长受到一定的影响。在饲料中添加外源酶被证明是有效解决方法之一。水解酶是催化水解反应的一类酶的总称，是提高饲料消化率和利用率的重要酶之一。如饲料中添加脂肪酶可促进脂肪的消化分解，释放出更多具有类似抗生素作用的中链脂肪酸；并且还可促进脂溶性维生素及其他微量元素的吸收，提高饲料转化率。除脂肪酶外，蛋白水解酶也可用作饲料添加剂，可催化多肽或蛋白质的水解，释放游离氨基酸，提高饲料中蛋白成分的消化吸收率，促进畜禽的生长。羧肽酶(CPs)属于蛋白水解酶类，能从肽链的C端逐个降解、释放游离氨基酸。将其添加在饲料中，能显著提高牲畜消化能力。但由于羧肽酶在动物胃中的酸性环境及内源消化酶(胃蛋白酶和胰蛋白酶)环境中存留时间较长，酶的稳定性受到较大影响。虽可使用适当的稳定剂降低羧肽酶受到的影响，但有时因加工时间过长、温度过高会严重破坏其催化活性。为满足羧肽酶不断发展的应用需求，人们对于羧肽酶特性提出更高的要求，尤其是耐酸抗蛋白酶特性。此特性可使羧肽酶在无稳定剂保护下顺利通过胃部酸性环境，避免因加工缺陷对其活性的破坏。因此获得具有耐酸抗蛋白酶特性的羧肽酶是目前羧肽酶的研究热点之一。羧肽酶主要来源于微生物、植物和哺乳动物。哺乳动物来源羧肽酶由胰腺分泌至消化道后，经过酸性食糜浸泡和内源性消化酶降解后可帮助消化食物，具有催化活性，所以推测其具有耐酸抗蛋白酶特性。哺乳动物幼崽消化器官不发达，消化机能不完善，如仔猪出生时胃内仅有凝乳酶，胃蛋白酶很少，且由于胃底腺部缺乏游离盐酸，胃蛋白酶基本没有活性。而肠腺和胰腺发育较完善，胰蛋白酶活性较高。可针对此特点构建能够检测耐酸抗蛋白酶特性的简化模型。酶作为一种高效生物催化剂，专一性是其显著的特点，不同的底物需要有不同的酶来催化分解。由于饲料中含有多种营养成分。实用单一酶制剂难以达到理想的效果。解决该问题方法较多，其中一种是获得具有多功能催化特性的酶制剂。将该种酶制剂添加在饲料中，能加快营养物质的吸收利用，并进一步降低饲料成本。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具备转酯功能和耐酸抗蛋白酶特性的猪胰腺羧肽酶A1，本专利技术提供的猪胰腺羧肽酶A1(CPA1)以酪蛋白和橄榄油为底物时，比活力分别为53.14U/mg和22.4U/mg，同时具备蛋白酶活性和转酯活性。本专利技术实现目的的技术方案是：一种具备转酯功能和耐酸抗蛋白酶特性的猪胰腺羧肽酶A1，其氨基酸序列如序列1所示：而且，所述猪胰腺羧肽酶A1从猪胰脏中提取。而且，所述猪胰腺羧肽酶A1在以酪蛋白和橄榄油为底物时，比活力分别为53.14U/mg和22.4U/mg。而且，所述猪胰腺羧肽酶A1转酯活性最适反应pH为7.4，而其蛋白酶活性最适反应pH为7.6。而且，所述猪胰腺羧肽酶A1在pH3.0～7.0范围内稳定，酶活力均保持在90％以上而且，所述猪胰腺羧肽酶A1的蛋白酶和转酯活性的最适反应温度均为35℃，而且，所述猪胰腺羧肽酶A1的转酯活性在30℃～50℃之间维持在80％以上。本专利技术的优点和有益效果为：1、本专利技术提供的猪胰腺羧肽酶A1(CPA1)以酪蛋白和橄榄油为底物时，比活力分别为53.14U/mg和22.4U/mg，同时具备蛋白酶活性和转酯活性。2、本专利技术提供的猪胰腺羧肽酶CPA1经过pH2.0酸性环境和胰蛋白酶处理后，其酶活残留率分别为95.65％和78.14％，能够抵抗强酸环境和胰蛋白酶的降解，将CPA1添加在饲料中，可进一步加快畜禽对营养物质的吸收。附图说明图1离子交换层析；图2粗酶液和纯化后酶液的SDS-PAGE分析；M：蛋白marker；1：CPA1粗酶液；2：30％盐梯度洗脱样品；图3质谱分析比对结果；图4CPA1的底物特异性；图5CPA1最适反应pH；图6CPA1经不同pH缓冲液处理60min后的稳定性；图7CPA1最适反应温度；图8CPA1在不同温度下保温60min后的热稳定性；图9CPA1经不同活性胰蛋白酶处理后的SDS-PAGE分析；M：蛋白marker；0～8：胰蛋白酶活性依次为0，10，20，30，40，50，60，70和80U/ml。具体实施方式下面通过具体实施例对本专利技术作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本专利技术的保护范围。一种具备转酯功能和耐酸抗蛋白酶特性的猪胰腺羧肽酶A1，其提取和活性说明如下：1、提取过程如下：取成年家猪新鲜胰脏500g，用绞肉机搅碎，再与2～3倍体积pH7.0，50mmol/L磷酸盐缓冲液混合。将其在高速组织捣碎机中打碎，离心出去残渣，去上清粗酶液4℃保存。2、活性的测定过程如下：2.1Folin显色法：取1ml适当稀释的酶液，37℃水浴预热1min，加入1ml1％酪蛋白溶液，37℃水浴保温10min，迅速加入2ml0.4mol/L三氯乙酸终止反应，室温静置15min，10000r/min离心10min，取上清1ml，置于试管中，加入5ml0.4mol/LNa2CO3溶液及1ml福林酚工作液，测定680nm吸光度。对照在加入酪蛋白溶液前先加入三氯乙酸，其余条件相同。将每分钟水解酪蛋白释放1ug酪氨酸的酶量定义为一个蛋白酶活力单位。2.2橄榄油滴定法：取4ml橄榄油乳化液加入到5ml50mmol/L的磷酸盐缓冲液中(pH7.0),并加入1ml适当稀释的酶液，在37℃，100r/min震荡条件下反应15min，加入10ml95％乙醇终止反应。用0.05mol/LNaOH滴定样品生成的脂肪酸，计算消耗NaOH的量。酶活单位的定义：在37℃，pH7.0的条件下，样品水解油脂每分钟释放1umol游离脂肪酸所需的酶量为一个活力单位(U)。2.3分光光度法：将pNPB溶液与50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)以1：9混合，吸取2.7ml上述混合液，加入300ul适当稀释过的酶液，37℃反应15min，用3ml95％乙醇终止反应，在410nm波长处测定样品溶液的吸光值。酶活单位的定义：在37℃，pH7.0的条件下，样品水解4-硝基苯丁酸酯(pNPB)每分钟释放1umol对硝基苯酚(pNP)所需的酶量为一个酶活力单位(U)。3、蛋白浓度测定蛋白质浓度的测定采用Bradford法，以牛血清白蛋白为标准蛋白。4、离子交换层析：使用20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)平衡HiTrapQ柱，排除其中气泡，在恒定低温操作下，适当稀释的粗酶液以恒定流速通过蠕动泵流过层析柱，后利用1mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱，收集洗脱样品，进行酶活和蛋白质浓度测定。5、羧肽酶水解蛋白特性的检测5.1最适反应pH：使用pH6.0～12.050mmol/L的缓冲液(pH6.0-8.0NaH2PO4/Na2HPO4缓冲液、pH9.0-12.0硼酸-硼酸钠缓冲液)配置1％酪蛋白溶液，按照Folin显色法测定CPA1的残余活力。残余酶活最大pH即为最适pH，其酶活设为100％，计算其他pH条件下的相对活力。5.2pH稳定性：利本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具备转酯功能和耐酸抗蛋白酶特性的猪胰腺羧肽酶A1，其特征在于：其氨基酸序列如序列1所示。

【技术特征摘要】
1.耐酸抗胰蛋白酶特性的猪胰腺羧肽酶A1以4-硝基苯丁酸酯为底物在转酯反应中...

【专利技术属性】
技术研发人员：路福平，张会图，冯士元，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津;12