拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因SCPL41及其T-DNA突变体在提高植物抗醇类胁迫、对盐胁迫敏感、对脱落酸不敏感、调控种子大小中的应用。借助模式植物拟南芥，通过转基因技术证实SCPL41基因的缺失表达使得拟南芥可以耐受一定浓度正丁醇胁迫，并且对脱落酸(abscisic?acid，ABA)不敏感、对盐胁迫敏感、种子个体显著小于野生型拟南芥的种子。SCPL41基因在众多生理过程中的作用，表明其参与许多植物的生长发育过程以及响应逆境胁迫参与信号转导过程，为利用转移磷脂酰基反应来合成新的磷脂提供新的技术方法，而且这些功能在农作物生产中有较好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域。具体地，本专利技术涉及一种拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因SCPL41及其T-DNA插入突变体在培育耐受正丁醇胁迫、对脱落酸不敏感、对盐胁迫敏感、而且种子个体显著小于野生型拟南芥的种子的转基因植物中的应用。
技术介绍
植物在生长发育过程中往往会受到各种生物或非生物因子的胁迫。植物在接收到外界胁迫信号之后，会及时调整自身的代谢或物质含量来响应外界信号。膜脂是生物膜的骨架成分，而且能在磷脂酶的催化作用下水解后产生的产物来参与多种生理过程以及环境刺激引起的细胞反应。转移磷脂酰基反应(transphosphatidylation)是指,在磷脂酶 D (phospholipaseD, PLD)的催化作用下,甘油磷脂的磷酸二酯键发生断裂，并把磷脂的磷脂酰基转移到伯位醇上或者水上，从而生成磷脂酰醇或者磷脂酸的反应。磷脂酶D (phospholipase D，PLD)广泛存在于哺乳动物的组织与细胞中，催化其主要底物磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine, PC),所生成的直接和间接产物磷脂酸(phosphatidic acid, PA)和二脂酰甘油(diacylglycerol, DAG)与溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)均是重要的第二信使物质。这条生化通路被认为是细胞信号转导的重要途径之一。但是在短链伯位醇(从甲醇到正庚醇)存在的情况下，PLD优先催化PC与短链伯位醇发生转磷脂酰基反应(transphosphatidylation)产生稳定的磷脂酰醇(phosphatidyl alcohol)和水,从而抑制了 PA的生成，也就阻止了 PA的进一步代谢以及响应信号的进一步向下传递。由于PLD的转移磷脂酰反应这一特性，研究者们通常使用醇类物质作为PA经PLD途径生成的抑制剂来探究PLD的功能，而且此反应体现出许多生物学作用。转移磷脂酰反应在动物中的生物学作用主要体现于利用转移磷脂酰反应探究乙醇对动物组织或器官的伤害机制和PLD在伤害过程中的作用，以及对转移磷脂酰反应异常引起的疾病的致病机理研究。在乙醇的浸入下，动物细胞中大量的磷脂发生转移磷脂酰反应，形成磷脂酰乙醇(phosphatidylethanol, PtdEt), PtdEt被认为是造成磷脂代谢混乱的原因之一。PtdEt可通过增加膜流动性而改变膜的物理化学特性，它对与膜相连的两种酶有相反的作用，削弱NaVK+-ATP酶的活性，而增强5核苷酸酶的活性。PtdEt还可作为磷脂酰丝氨酸的取代物激活大脑PKC Y，从而改变原有的激活模式。K6tter等(2000)发现乙醇和正丁醇抑制了 PKC活性、阻断了 PLD信号通路，造成大鼠脑皮质星形胶质细胞增殖受阻。这一发现将有助于揭示酗酒引起的胚胎发育不良的原因。以上实验结果及推测暗示着由PLD介导的转移磷脂酰反应可能是导致由乙醇引发的疾病的起因。另外，PLD催化PC与甘油二酯发生转移磷脂酰反应生成的bis-PA与激活人类纤维原细胞血管缓激肽有关；山梨醇的不正常积累引发了转移磷脂酰反应，生成磷脂酰-山梨醇，而这种异常的磷脂的产生改变了膜脂质体的代谢，从而导致糖尿病的发生；而转移磷脂酰反应异常还可能是导致的糖尿病心肌症及心肌缺血再灌注损伤的原因。尽管在植物和微生物中，转移磷脂酰反应的生物学作用仍没有得到具体的体现，但随着研究工作的深入和一些有意义的现象的发现，转移磷脂酰反应的生物学作用正渐渐的得到挖掘。Waltonand Goldfine (1987)发现梭菌属PLD催化的转移磷脂酰反应与膜磷脂重建有关。Dhonukshe等(2003)用正丁醇处理烟草BY-2细胞时发现，转移磷脂酰反应导致了细胞骨架重组，且不同来源的PLD具有不同的转移磷脂酰反应的潜能，PLD同功酶对底物具有立体选择性。这些都暗示着以牺牲重要信号物质-磷脂酸(PA)为代价，而发生转移磷脂酰反应，这一机制必定具有重要的生理作用。在植物中，一般认为水的含量比羟基化合物高50倍时，转移磷脂酰反应仍然存在很高的活性。PLD在一些微生物中表现出更高比例的转移磷脂酰反应活性。来自甘蓝中的PLD2和来自链霉菌(Sti^ptomyces sp.)的PLD表现出相似的水解能力，但在同样的处理下，链霉菌PLD催化磷脂酰胆碱(PC)转化为磷脂酰乙醇胺(PE)的能力比甘蓝PLD2高出24倍，而链霉菌PLD几乎没有水解产物磷脂酸(PA)生成。尽管如此，研究者还是在一些微生物和动物PLD上发现了有意义的现象。色褐链霉菌(Streptomyceschromo-fuscus) PLD是一种|丐离子依赖型酶,且转移磷脂酰反应能力较弱。但以天然存在的羟基化合物甘油二酯作为受体底物时，在色褐链霉菌PLD的催化下发生了·转移磷脂酰反应，反应形成的新磷脂(磷脂酰-醇)可以直接被PLD再水解而生成PA。而钙离子能够引起含PA、磷脂酰丝氨酸及心磷脂等带负电荷磷脂脂质体膜问的融合。因此，由于转移磷脂酰反应的发生使PA的量相对减少，进而促进了水解反应的发生，而水解反应产物的PA在钙离子的作用下与寄主细胞的脂质体问发生膜融合，所以由色褐链霉菌PLD催化的这一系列反应促进了细菌和寄主细胞之间的膜融合，可以看出，磷脂酰-醇的生成有助于细菌侵染真核细胞。另外，微生物和植物PLD作为生物催化剂在磷脂合成工艺中广泛应用。这类研究主要集中在PLD的催化反应效率，底物结构和反应体系的影响，转移磷脂酰反应和水解反应比，以及PLD在细胞外的稳定性等。微生物PLD的发现使转移磷脂酰反应用于规模化合成磷脂成为了现实。80年代起，国外的学者纷纷报道了利用PLD的转移磷脂酰反应制备和合成高纯度的多功能特性的单一磷脂及稀少磷脂，如肌醇磷脂、卵磷脂、丝氨酸磷脂、甘油酰磷脂、心磷脂、磷脂酰葡萄糖、磷脂酰-D-丝氨酸。在医药工业中，利用PLD的碱基转移活性可将一些多肽、核苷和多糖类药物通过配位键连接在磷脂载体上，制成具有特殊疗效的脂质体。利用PLD还可合成一些抗肿瘤试剂，从而为抗肿瘤药物的酶法合成开辟了新的方向。通过筛选抗正丁醇的突变体可以更直接有效的找到正丁醇胁迫的作用靶点，对进一步解析转移磷脂酰基反应发生机制以及生物学意义提供更为直接的证据。而bis4突变体就是在正丁醇胁迫下而得到的正丁醇不敏感突变体，通过TAIR-PCR鉴定和测序分析，得到突变体 bis4 属于 SCPL41 (serine carhoxypeptidase-like 41, SCPL41)基因功能缺失型突变体。目前，越来越多的证据表明丝氨酸羧肽酶蛋白以及丝氨酸羧肽酶类蛋白在许多逆境响应过程中都起到调控作用。丝氨酸羧肽酶(seine carboxypeptidases, SCP)是一类真核生物蛋白水解酶,亚基分子量40000 75000Da，主要存在于动物的溶酶体和植物或真菌的液泡中。在酸性pH环境下，它们同时具有C末端蛋白水解酶、酯酶和脱酰胺酶的活性，参与多肽和蛋白质的加工、修饰与降解等多个重要环节。植物丝氨酸羧肽酶功能的研究主要集中种子萌发过程中的储藏蛋白的转换和动员、细胞程序性死亡过程中细胞成分的自溶、油菜素内酯信号转导、种子发育、植物次级代谢的酰基转移等。丝氨酸羧肽酶类蛋白是与SCP氨基本文档来自技高网...
【技术保护点】
拟南芥基因SCPL41在培育抵抗醇类物质胁迫以及改变转移磷脂酰基反应的转基因植物中的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李唯奇，贾艳霞，苏一兰，
申请(专利权)人：中国科学院昆明植物研究所，
类型：发明
国别省市：
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