一种类凝血酶基因及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种尖吻蝮蛇来源的类凝血酶基因及其应用，其目的是提供一种能在大肠杆菌中高效表达该类凝血酶的方法。本发明专利技术所提供的类凝血酶基因的核苷酸序列如SEQNO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQNO.2所示；将所述的类凝血酶基因克隆到pET-32a载体上，得到的重组载体转化大肠杆菌Rosetta2(DE3)中诱导表达该类凝血酶。本发明专利技术制备出能够高效表达该类凝血酶基因的重组生产株，实现类凝血酶产业化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，更具体涉及一种蛇毒类凝血酶及其编码序列、含有该序列的重组质粒和菌株，以及由所述序列编码的类凝血酶在大肠杆菌中的表达及其应用。
技术介绍
蛇毒类凝血酶主要存在于蝮亚科(和蝰科(CroiahWae)家族，是丝氨酸蛋白酶中的肽链内切酶，属于胰蛋白酶家族。主要功能是特异性的水解纤维蛋白原，释放纤维蛋白肽A (Fibrinopeptide, FPA)和B (FPB)。类凝血酶不激活凝血因子，降解纤维蛋白原产生可溶性、侧链不交联的高聚纤维蛋白肽片段，形成的(血)凝块不稳定，在体内易被网状内皮系统或正常纤溶系统清除。鉴于蛇毒类凝血酶在降解纤维蛋白原时的独特生物活性，已作为抗血栓药物用于心血管疾病和血液栓塞性疾病及术后血栓形成的预防和治疗有·多年的历史。在临床上除用于脑梗塞、血栓闭塞性脉管炎、股动脉栓塞、肺栓塞等血管栓塞性疾病及预防术后血栓再发等治疗外，对肾病、红斑狼疮、病毒性肝炎及雷诺氏病等有一定疗效。针对蛇毒类凝血酶的研究可追溯到上世纪三十年代，迄今商品化的蛇毒类凝血酶制剂有马来西亚红口蝮蛇(Xklloselasma rhodostoma )类凝血酶Ancrod (商品名Arvin )、美洲矛头峻蛇atrox类凝血酶 Batroxobin (商品名 Reptilase )、尖吻峻蛇acwiiAs)类凝血酶Acutin (商品名Defibrase )、长白山乌苏里峻蛇W1S1Stfriefl1Si1S)类凝血酶 Gussurobin (商品名 Defibrase )以及短尾峻蛇(.GloycIius知ehcawdks)类凝血酶“抗栓酶”。这些酶来源于天然蛇毒，多个因素限制了它们的规模化制备和临床应用。蛇毒含有多种毒性蛋白水解酶，影响血液循环和神经系统，即使是痕量残留都可引发副反应，严重时可致死。高纯度的蛇毒类凝血酶耗费高额分离纯化成本。此外，国家法律明确规定对稀有物种和生态资源的保护，强制禁止捕杀珍惜蛇种。综上所述，研发类凝血酶制剂的替代方案势在必行。利用生物化学与分子生物学手段生产重组蛇毒类凝血酶避免毒性蛋白水解酶杂质残留造成的风险，同时易于产品规模化和产业化，是取代天然蛇毒类凝血酶制备的有效途径。研究发现，蛇毒类凝血酶活性中心序列存在高度保守性，利用机理研究较为透彻的大肠杆菌表达体系进行闻效表达成为当如研究的重点。另外，原核体系对外源基因表达无法建立正确的链内或链间二硫键，引起外源蛋白错误折叠，致使目的蛋白活力丧失或降低。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种蛇源的类凝血酶基因(将其命名为acutobin00-14),以及将其在大肠杆菌中克隆表达,解决上述现有技术的不足,构建能够高效表达的类凝血酶重组生产菌株，实现一种蛇毒类凝血酶的产业化生产，纯化所得目的蛋白可进一步拓宽其应用范围。由于原核体系对外源基因表达无法建立正确的链内或链间二硫键，引起外源蛋白错误折叠，致使目的蛋白活力丧失或降低。为克服这一问题，本专利技术采用融合硫还原蛋白基因的pET_32a质粒载体，有效维系细胞内的二硫键以此来维系细胞氧化还原状态。同时，将质粒载体携带的His标签(多位六个组氨酸残基组成的序列)与目标蛋白融合，利用该标签特异性的与二价金属离子(如镍、锌等)发生螯合作用提高纯化效率。在His标签下游与多克隆位点间，该质粒存在一个肠激酶酶切位点，通过对融合蛋白酶切，可进行初步验证。本专利技术的一种蛇毒类凝血酶基因，其核苷酸序列如SEQ NO. I所示，其编码的氨基酸序列如SEQ NO. 2所示。所述类凝血酶基因经以下步骤获得 (1)从蛇毒腺中分离提取总RNA，将mRNA反转录为cDNA，再用PCR扩增；扩增结束后取PCR产物进行电泳检测，并回收凝胶中的目标基因； (2)将步骤(I)所得目标基因进行DNA序列测定，并在NCBI数据库中进行分析比对，最终确定类凝血酶基因。将所述的类凝血酶基因克隆到pET-32a载体中，得到类凝血酶基因重组载体。将所述重组载体导入大肠杆菌，得到含有类凝血酶基因重组载体的大肠杆菌细胞。培养所述的含有类凝血酶基因重组载体的大肠杆菌细胞，通过发酵诱导其表达，产生类凝血酶。所述的类凝血酶通过硫酸铵沉降，离子交换层析和亲和层析纯化，得到纯酶形式的类凝血酶。本专利技术的显著优点 本专利技术利用基因工程手段制备能够高效表达蛇毒类凝血酶的生产株，实现蛇毒类凝血酶产业化生产,并获得优质的蛇毒类凝血酶产品。本专利技术方法生产成本低,且产品生物学活性高、纯度高，适用于大规模的生产应用，本专利技术制备的类凝血酶在医学上有广泛的应用前旦-5^ O附图说明图I为源于尖吻蝮蛇的蛇毒腺acutobin00-14基因(l_403bp)与其他来源类凝血酶(28183 :acutobin00-14、AF159057 :尖吻蝮蛇类凝血酶、D67083 :赤尾鲐类凝血酶、AF395768 :福建竹叶青类凝血酶、AF056033 :亚洲蝮蛇类凝血酶、EF690365 :白唇竹叶青类凝血酶)核苷酸序列的比较； 图2为源于尖吻蝮蛇的蛇毒腺acutobin00-14基因(404-709bp)与其他来源类凝血酶(28183 :acutobin00-14、AF159057 :尖吻蝮蛇类凝血酶、D67083 :赤尾鲐类凝血酶、AF395768 :福建竹叶青类凝血酶、AF056033 :亚洲蝮蛇类凝血酶、EF690365 :白唇竹叶青类凝血酶)核苷酸序列的比较； 图3为源于尖吻蝮蛇的蛇毒腺acutobinOO-14基因类凝血酶与其他来源类凝血酶(28183 :acutobin、AF159057 :尖吻蝮蛇类凝血酶、D67083 :赤尾鲐类凝血酶、AF395768 :福建竹叶青类凝血酶、AF056033 :亚洲蝮蛇类凝血酶、EF690365 白唇竹叶青类凝血酶)氨基酸序列的比较；图4为源于尖吻蝮蛇的蛇毒腺acutobinOO-14基因类凝血酶在质粒pET32a上的重组子结构图及质粒pET-32a图谱； 图5为源于尖吻蝮蛇acutobinOO-14基因类凝血酶在大肠杆菌中诱导表达目的蛋白的SDS-PAGE 图谱； 图6为源于尖吻蝮蛇acutobinOO-14基因类凝血酶经过硫酸铵沉降、阴离子交换层析和镍柱亲和层析纯化后目的蛋白SDS-PAGE图谱； 图7源于尖吻蝮蛇acutobinOO-14基因类凝血酶酶活力鉴定图。具体实施方式 以下结合具体的实施例，进一步阐述本专利技术，但不以任何形式限制本专利技术。实验材料和试剂 I.菌株和载体 大肠杆菌Rosetta2 (DE3)及表达载体pET_32a购自Novagen公司；pCP2. I Vector购自 invitrogen 公司。2.酶类及其他生化试剂 限制性内切酶、DNA Maker、蛋白质Maker均购自Fermentas (MBI),其他常规试剂为上海生工或进口。3.培养基 使用的培养基LB培养基 4.本专利技术中所用到的生物化学技术均为本领域中的常规技术。在以下实施例中，除非特殊说明，所有实验操作均按照以下实验手册或文献中的相关章节或部分进行，包括J.莎姆布鲁克等，分子克隆实验指南；赵永芳等，生物化学技术原理及其应用(第二版)；朱检等，生物化学实验。实施例I类凝血酶基因的克隆 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种类凝血酶基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ？NO.1所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘树滔，程欲，饶平凡，李仁宽，郭春腾，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：