一种蛇毒类凝血酶及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种蛇毒类凝血酶及其编码基因与应用，其目的是提供一种蛇毒类凝血酶、蛇毒类凝血酶成熟蛋白及它们的编码基因与以该蛇毒类凝血酶和／或蛇毒类凝血酶成熟蛋白为活性成分的具有溶栓和防止血栓形成作用的药物。本发明专利技术所提供的蛇毒类凝血酶具有下述氨基酸残基序列之一：１）序列表中的序列１；２）将序列表中序列１的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有溶栓和防止血栓形成作用的蛋白质。该重组表达的蛇毒类凝血酶成熟蛋白具有蛇类类凝血酶所具有的酰胺酶解活性、精氨酸酯酶活性，可以特异性地降解纤维蛋白原的β链，还可降解纤维蛋白原引起的血栓，具有降粘、溶栓的功效。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及蛇毒类凝血酶及其编码基因与应用，特别是涉及蛇毒类凝血酶、蛇毒类凝血酶成熟蛋白及它们的编码基因与以该蛇毒类凝血酶或蛇毒类凝血酶成熟蛋白为活性成分的具有溶栓和防止血栓形成作用的药物。
技术介绍
血栓形成是外科手术的常见并发症，也是现代介入性血管成形术后发生再阻塞的重要因素以及多种心脑血管疾病的致病、致死原因。生理性血栓形成是止血的一种手段，而病理性血栓形成则可导致相关的脏器发生功能障碍。目前，心、脑部位的血栓性疾病已成为致残率与致死率最高的疾病之一，严重威胁到人类的健康。据统计，全世界有血栓栓塞性患者约1500万，所需溶栓剂的潜在市场可达20亿美元，因而世界上很多国家都致力于这方面药物研究与开发。血栓是血液成份在血液循环过程中形成的一种非均质性结构的凝块。血栓由血小板、白细胞、红细胞和纤维蛋白构成，各种成份所占的比率因血管部位和血液流动条件不同而有所差异。血栓形成是一个复杂的且牵涉面极广的生理或病理过程，主要表现为血管内皮损伤、血液成分改变和血流动力学异常。内皮细胞受损和皮下胶原组织暴露会引发血小板的粘附和聚集。例如，血管性假血友病因子一端与内皮胶原结合，一端与血小板膜血小板表面糖蛋白Ib(GP Ib)结合，从而发生血小板的粘附，粘附的血小板随即被激活，并引发血小板的聚集，即在Ca2+辅助下和二个血小板膜上的膜蛋白GP IIb-IIa相结合；活化的血小板快速发生释放反应释出其颗粒内容物，如5-羟色胺、ADP、Ca2+、B-血小板球蛋白、花生四烯酸等，这些释放物又进一步促进血小板的粘附、聚集与活化，使血小板聚合物不断增大。同时，内皮细胞的破损激活一系列凝血因子，并进一步引发体内凝血因子的活化，纤维蛋白原在凝血酶作用下生成纤维蛋白多肽A和纤维蛋白多肽B，两种纤维蛋白多肽转化成纤维蛋白单体(α，β，γ)2后自发聚合成不稳定的纤维蛋白多聚体，不稳定的纤维蛋白多聚体在Ca2+、XIII因子的作用下交联成稳定的纤维蛋白多聚体，这就是血栓的主要基质。纤维蛋白支持嵌入血小板血栓，最终形成血小板一纤维蛋白凝块。实质上，血栓在体内不是永久性的结构，它处于纤维蛋白的不断沉积和溶解的动态平衡之中。因此，清除纤维蛋白的前体，可有效地预防前者而控制血栓的发展，并增强人体正常的纤溶作用。蛇毒类凝血酶在体内具有较强的溶栓效果，它具有精氨酸酯酶活性，能够直接作用于纤维蛋白原，水解释放血纤肽2，导致纤维蛋白的单体首尾聚合而凝固，被称为类凝血酶。但它在体内不激活凝血因子I，由它水解生成的纤维蛋白凝块不产生侧链交联，对纤溶酶的消化高度敏感，易被天然网状内皮系统或正常的纤溶作用所清除，因此导致胞浆中纤维蛋白原浓度显著下降，表现降纤、抗凝的效果。临床上，蛇毒类凝血酶已成为防治血栓栓塞性疾病的有效药物。纤维蛋白原是决定血液粘度的重要因素之一，类凝血酶减低了血浆中纤维蛋白原水平，从而降低了全血粘度及血浆粘度，增强了血流速度。同时，与凝血酶相反，类凝血酶不诱导血小板凝聚和释放，它们与富含血小板的血浆所形成的凝块不收缩，使机体能维持正常的止血功能。国外已有Ancrod和Batroxobin蛇毒抗凝剂，国内则有五步蛇毒祛纤酶、东北白眉蝮蛇抗栓酶(清栓酶)、江浙蝮蛇抗栓酶等用于临床。虽然上述药物的名称不同，但主要成分是一致的，均为类凝血酶。这些抗凝剂因具有祛纤、降粘、溶栓、解聚等独特的性质，已用于临床治疗脑血栓形成、脉管炎、治疗冠心病、心肌梗死，也有人用于治疗癌痛综合症。目前认为抗栓酶是治疗脉管炎、深静脉炎、静脉栓塞形成最为理想的有效药物。临床上试用的适应症有深部静脉血栓形成(并发症或不并发肺栓塞)，视网膜中央静脉血栓形成，心肌梗死，来自人工瓣膜的栓塞，阴茎异常勃起，镰状细胞贫血，类风湿性关节炎，脏器移植排斥，血栓形成经外科或纤维溶解治疗后复发的预防，静脉外科的抗凝和血栓形成的预防，体外血液透析，人工心肺生命的维持，外周动脉阻塞和冠状动脉狭窄等。一些结果证明它们是很有希望的治疗剂。蛇毒类凝血酶主要存在于蝰科中的蝮亚科蛇的蛇毒中，蝰亚科中的有些蛇毒也含有类凝血酶。然而，在海蛇科中还未有报道发现过类凝血酶，并且现在临床运用的蛇类类凝血酶为从蛇毒中提纯而来，产量有限，其中含有的不纯的蛇类杂蛋白或酶类正是产生较大毒副作用的原因之一。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种蛇毒类凝血酶、蛇毒类凝血酶成熟蛋白及它们的编码基因。本专利技术所提供的蛇毒类凝血酶，名称为TLE，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №1；2)将序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有溶栓和防止血栓形成作用的蛋白质。其中，序列表中的SEQ ID №1由265个氨基酸残基组成。该蛇毒类凝血酶成熟蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №3；2)将序列表中SEQ ID №3的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有溶栓和防止血栓形成作用的蛋白质。序列表中的SEQ ID №3由232个氨基酸残基组成，是SEQ ID №1的自氨基端第34-265位氨基酸残基序列。上述蛇毒类凝血酶的编码基因(TLE)也属于本专利技术的保护范围。它可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №1蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列具有95％以上同源性，且编码具有溶栓和防止血栓形成功能的蛋白质的DNA序列；4)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。其中，序列表中的SEQ ID №2由827个碱基组成，其编码序列为自5’端第1到第795位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列的蛋白质。上述蛇毒类凝血酶成熟蛋白的编码基因也属于本专利技术的保护范围。它可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №4的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №3蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №4限定的DNA序列具有95％以上同源性，且编码具有溶栓和防止血栓形成功能的蛋白质的DNA序列；4)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。其中，序列表中的SEQ ID №4由728个碱基组成，其编码序列为自5’端第1到第696位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №3的氨基酸残基序列的蛋白质。所述高严谨条件为杂交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。含有本专利技术蛇毒类凝血酶的编码基因及其成熟蛋白的编码基因的表达载体、细胞系及工程菌均属于本专利技术的保护范围。扩增上述蛇毒类凝血酶的编码基因及其成熟蛋白的编码基因中任一片段的引物对也在本专利技术的保护范围之内。本专利技术的另一个目的是提供一种表达上述蛇毒类凝血酶及其成熟蛋白的方法。本专利技术所提供的表达上述蛇毒类凝血酶的方法，是将含有上述蛇毒类凝血酶编码基因的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到蛇毒类凝血酶。本专利技术所提供的表达上述蛇毒类凝血酶成熟蛋白的方法，是将含有上述蛇毒类凝血酶成熟蛋白编码基因的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到蛇毒类凝血酶成熟蛋白。所本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛇毒类凝血酶，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：１）序列表中的ＳＥＱＩＤ№：１；２）将序列表中ＳＥＱＩＤ№：１的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有溶栓和防止血栓形成作用的蛋白 质。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：顾军，陈师勇，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]