【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及药物化学，尤其涉及一种靶向筛选海洋真菌中神经氨酸酶抑制剂的方法。
技术介绍
1、流感是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染性疾病，其宿主多、变异快、易发生重组，季节性流感每年均会造成地区性疫情，大流行流感每隔几年导致全球性的流感大爆发，高致病性禽流感病情凶险，死亡率高，对世界公共卫生体系构成巨大威胁。神经氨酸酶(neuraminidase，na)是流感病毒包膜表面上的ii型糖蛋白，主要作用是水解唾液酸的酮苷键从而促进病毒颗粒释放；同时有助于病毒血凝素与宿主细胞糖蛋白的唾液酸基结合，防止血凝素与糖蛋白的聚集，促进病毒感染，与流感病毒的复制和传播过程关系极其密切。另外，神经氨酸酶活性位点的氨基酸序列在甲、乙型病毒中均高度保守，意味着研发神经氨酸酶抑制剂可以同时治疗甲、乙型流感病毒。然而，目前已有的抗流感药物仍存在疗效不佳、不良反应较大等问题，因此，亟待开发一种高效、天然、安全的神经氨酸酶抑制剂。
2、海洋，具有高压、高盐、无光照等特殊的环境，这逼迫海洋源真菌必须在极端环境下生存繁殖，产生结构新颖，生物活性优越的次级代谢产物。在人们对海洋源天然产物的探索过程中，海洋源青霉菌天然产物在其中扮演着重要的角色，具有结构类型多、活性丰富的特点，已成为新型药物前体的有力来源之一。但传统活性产物发现的过程存在目标不明确、操作繁琐、工作量大、周期长、活性成分在分离过程中易丢失等诸多不足，无法适应快速发现活性结构的需要。
3、因此，建立高效快速灵敏的筛选方法，从海洋生物中筛选出有效的具神经氨酸酶抑制活性的成分，为进
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是：本专利技术提供一种靶向筛选海洋真菌中神经氨酸酶抑制剂的方法，本专利技术采用磁珠配体垂钓策略结合半制备液相色谱的方法，简单易行，能够对海洋真菌中具神经氨酸酶抑制活性的化合物进行快速筛选。该方法体系的建立能够为从复杂天然代谢产物中快速筛选神经氨酸酶抑制剂提供理论依据。
2、为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：
3、本专利技术提供一种靶向筛选海洋真菌中神经氨酸酶抑制剂的方法，包括以下步骤：
4、a1、制备海洋真菌粗提物，再经萃取和硅胶层析后，得到活性最强组分；
5、a2、采用磁珠配体垂钓法从活性最强组分中筛选出特异性成分和非特异性成分；
6、a3、利用半制备液相色谱对筛选出的活性最强组分中特异性成分和非特异性成分进行层析，并进一步分离纯化，即得所述神经氨酸酶抑制剂。
7、本专利技术提出的一种靶向筛选海洋真菌中神经氨酸酶抑制剂的方法，首先，采用基于亲和层析的配体垂钓(ligand fish，lf)方法，运用固定化技术建立复杂的体系筛选策略，酶分子通过酰胺键固定在磁珠上，不仅提高了酶的稳定性以及酸碱耐受性，同时利用酶的强特异性与活性配体结合，将其从复杂组分中“垂钓”出来，提高了分离效率，具有快速、高效以及准确的特点。其次，通过优化的半制备液相色谱法，对筛选出的活性配体特异性成分进行快速、高效的制备和分离纯化。采用本专利技术方法所得神经氨酸酶抑制剂的抑制神经氨酸酶活性大大优于传统纯化化合物，有望应用于制备具有抗流感作用的药物中。
8、可选地，步骤a1中，所述海洋真菌粗提物的制备方法具体为：将海洋真菌菌株进行复苏和发酵培养，得到菌株发酵物，再以甲醇作为提取溶剂，进行超声处理，得到油状海洋真菌粗提物。
9、可选地，步骤a1中，所述萃取采用的溶剂为乙酸乙酯；
10、所述硅胶层析采用的洗脱剂依次采用体积比为10:1的石油醚：二氯甲烷、5:1的石油醚：二氯甲烷、2:1的石油醚：二氯甲烷、50:1的二氯甲烷：甲醇、20:1的二氯甲烷：甲醇、10:1的二氯甲烷：甲醇、5:1的二氯甲烷：甲醇，梯度洗脱，分别收集体积比为50:1的二氯甲烷：甲醇以及体积比为20:1的二氯甲烷：甲醇洗脱出的组分。
11、可选地，步骤a2中，所述磁珠配体垂钓法具体包括以下步骤：
12、a21、磁珠清洗、活化；
13、a22、将神经氨酸酶固定化在活化的磁珠上，再应用于活性最强组分中共孵育，进行相应活性配体的垂钓；
14、a23、通过磁分离架去除未结合物质，再加入缓冲液洗脱活性最强组分中非特异性成分，最后加入有机溶剂-缓冲液溶液将保留在磁珠上的活性最强组分中特异性成分进行洗脱。
15、可选地，步骤a21中，所述磁珠清洗、活化的方法具体为：采用10mm mest溶液对羧基磁珠溶液进行洗涤，利用磁分离架去除上清液，得洗净磁珠，再与200μl edc/nhs溶液混合，并置于37℃，810rpm金属浴中恒温孵育2h，活化磁珠中的羧基；
16、所述10mm mest溶液的制备方法为：称取0.533g mes，加入200ml无菌超纯水并磁力搅拌至完全溶解，用1m的hcl和nacl溶液调整mes溶液ph＝6.0，得到10mm mes溶液，随后取100ml mes溶液，加入50μltween-20，充分溶解，即可；
17、所述edc/nhs溶液的制备方法为：称取30mg edc和nhs粉末，用去离子水定容至6ml，即可。
18、可选地，步骤a22中，所述神经氨酸酶固定化的方法为：将650μl5mg/ml神经氨酸酶溶液加入至活化磁珠溶液中，并置于37℃，810rpm金属浴中恒温孵育2h，得到固定神经氨酸酶的磁珠溶液，采用1ml 0.01m含1％ gly和0.05％ tween-20的pbst溶液，清洗固定化后的磁珠，利用磁分离架去除上清液，最后加入1ml 0.01m含0.5％ gly的pbst溶液，即可；
19、所述pbst溶液的制备方法为：以g/ml计，称取nacl粉末30，kcl粉末0.2，na2hpo4粉末1.44，kh2po4粉末0.24，去离子水定容至800ml，得到pbs溶液，取0.01m pbs溶液，加入1％gly和0.05％ tween-20，磁力搅拌充分溶解，得0.01m含1％ gly和0.05％ tween-20的pbst溶液；取0.01m pbs溶液，加入0.5％ gly，磁力搅拌充分溶解，得0.01m含0.5％ gly的pbst溶液。
20、可选地，步骤a22中，所述孵育的条件为：37℃，810rpm的金属浴中恒温孵育2h。
21、可选地，步骤a23中，所述缓冲液为pbs缓冲液，所述有机溶剂-缓冲液溶液为甲醇-pbs溶液。
22、可选地，步骤a3中，所述半制备液相色谱的分离纯化的条件为：制备柱为c18柱，检测波长为210nm，流速为1ml/min，进样量为10μl，柱温30℃，流动相由流动相a和b组成，梯度洗脱，其中，流动相a为meoh+0.1％ fa，流动相b为h2o；
23、所述梯度洗脱的程序为：以体积比计，0min，流动相a为2％，流动相b为98％，10min，流动相a为2％，流动相b为98％，25min，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种靶向筛选海洋真菌中神经氨酸酶抑制剂的方法，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的靶向筛选海洋真菌中神经氨酸酶抑制剂的方法，其特征在于，步骤A1中，所述海洋真菌粗提物的制备方法具体为：将海洋真菌菌株进行复苏和发酵培养，得到菌株发酵物，再以甲醇作为提取溶剂，进行超声处理，得到油状海洋真菌粗提物。
3.如权利要求1所述的靶向筛选海洋真菌中神经氨酸酶抑制剂的方法，其特征在于，步骤A1中，所述萃取采用的溶剂为乙酸乙酯；
4.如权利要求1所述的靶向筛选海洋真菌中神经氨酸酶抑制剂的方法，其特征在于，步骤A2中，所述磁珠配体垂钓法具体包括以下步骤：
5.如权利要求4所述的靶向筛选海洋真菌中神经氨酸酶抑制剂的方法，其特征在于，步骤A21中，所述磁珠清洗、活化的方法具体为：采用10mM MEST溶液对羧基磁珠溶液进行洗涤，利用磁分离架去除上清液，得洗净磁珠，再与200μL EDC/NHS溶液混合，并置于37℃，810rpm金属浴中恒温孵育2h，活化磁珠中的羧基；
6.如权利要求4所述的靶向筛选海洋真菌中神经氨酸酶抑制剂的方法，其特征
7.如权利要求4所述的靶向筛选海洋真菌中神经氨酸酶抑制剂的方法，其特征在于，步骤A22中，所述孵育的条件为：37℃，810rpm的金属浴中恒温孵育2h。
8.如权利要求4所述的靶向筛选海洋真菌中神经氨酸酶抑制剂的方法，其特征在于，步骤A23中，所述缓冲液为PBS缓冲液，所述有机溶剂-缓冲液溶液为甲醇-PBS溶液。
9.如权利要求1所述的靶向筛选海洋真菌中神经氨酸酶抑制剂的方法，其特征在于，步骤A3中，所述半制备液相色谱的分离纯化的条件为：制备柱为C18柱，检测波长为210nm，流速为1mL/min，进样量为10μL，柱温30℃，流动相由流动相A和B组成，梯度洗脱，其中，流动相A为MeOH+0.1％FA，流动相B为H2O；
...【技术特征摘要】
1.一种靶向筛选海洋真菌中神经氨酸酶抑制剂的方法，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的靶向筛选海洋真菌中神经氨酸酶抑制剂的方法，其特征在于，步骤a1中，所述海洋真菌粗提物的制备方法具体为：将海洋真菌菌株进行复苏和发酵培养，得到菌株发酵物，再以甲醇作为提取溶剂，进行超声处理，得到油状海洋真菌粗提物。
3.如权利要求1所述的靶向筛选海洋真菌中神经氨酸酶抑制剂的方法，其特征在于，步骤a1中，所述萃取采用的溶剂为乙酸乙酯；
4.如权利要求1所述的靶向筛选海洋真菌中神经氨酸酶抑制剂的方法，其特征在于，步骤a2中，所述磁珠配体垂钓法具体包括以下步骤：
5.如权利要求4所述的靶向筛选海洋真菌中神经氨酸酶抑制剂的方法，其特征在于，步骤a21中，所述磁珠清洗、活化的方法具体为：采用10mm mest溶液对羧基磁珠溶液进行洗涤，利用磁分离架去除上清液，得洗净磁珠，再与200μl edc/nhs溶液混合，并置于37℃，810rpm金属浴中恒温孵育2h，活化磁珠中的羧基；
6.如权利要求4所述的靶向筛选海洋真菌中神经氨酸酶抑制剂的方法，其特征在于，步骤a22中，所述...
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