一种刺参高温胁迫应答基因pcsk9制造技术

本发明专利技术公开了一种刺参高温胁迫应答基因，即刺参前蛋白转化酶枯草溶菌素9基因，该基因全长cDNA序列为1338bp，编码376个氨基酸。荧光定量PCR表明，该基因常温条件下在刺参各组织均有表达，30℃高温胁迫后在各组织中均表现为下调表达，其中呼吸树中表达量变化最显著；在15℃-30℃范围内，pcsk9随着温度升高总体呈现表达量下降,?30℃约为15℃的1/2；在30℃高温胁迫0-3?h时间内，pcsk9表现为表达下调，表达量最小值0.5出现在2?h。该刺参高温胁迫应答基因的克隆获得，为研究刺参应答高温胁迫的内在分子机理及刺参品种选育改良提供候选基因基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程领域，具体涉及是一种刺參高温胁迫应答基因的全序列及其表达特性。
技术介绍
温度是影响水生生物生长和生理活动的重要因子，直接影响到生物个体的生长发育、摄食代谢、繁殖存活等生命过程。刺參是我国北方海參的主要养殖种类，主要分布在黄、渤海，是典型的温帯物种，限制其分布的主要因素就是海水温度。刺參具有“夏眠”的生态习性，夏眠期间消化道退化，体重也减轻，因此这一生态习性的存在明显延缓了刺參的生长速度，延长了养殖周期，给人工养殖造成了很大的弊端。 刺參的地域性分布和夏眠的生态习性都与温度相关，关于温度对刺參的影响以及刺參对温度变化响应等方面的研究，在国内外已经有许多报道，但在分子水平上的研究很少，温度影响刺參活动及分布的分子机制尚不清楚。如能通过分析温度胁迫下刺參基因的差异表达，就有可能获得胁迫相关基因，并在分子水平上阐明其表达调控的模式。获得可以作为刺參热应激指标的标记基因，可为探讨刺參应答高温胁迫的内在分子机理提供新的资料，为热抗性刺參品种选育改良和刺參夏眠机制研究提供分子基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种刺參高温胁迫应答基因序列及其表达特性，为研究刺參的热激胁迫反应机理提供基因资源。本专利技术提供了一种刺參高温胁迫应答基因是前蛋白转化酶枯草溶菌素9 -pcsk9基因，其cDNA序列全长为1338bp，如SEQ ID NO :1所示，其中l_31bp为5’非翻译区，1163-1338bp为3’非翻译区，开放阅读框为32-1162位核苷酸，编码376个氨基酸，如SEQID NO :2所示。本专利技术公开的前蛋白转化酶枯草溶菌素9基因是筛选自刺參高温胁迫差异消减文库中的差异表达基因，消减文库克隆SSHP3H7T7测序获得前蛋白转化酶枯草溶菌素9部分序列，后利用RACE技术获得该基因cDNA序列全长。常温正常培养条件下pcsk9基因在刺參各组织中均有表达，体壁中的表达量最闻，在呼吸树中表达量最少(图I);闻温胁迫后pcsk9在各组织中均表现为下调表达,其中呼吸树中表达量变化最显著(图2)。在15°C -30°C范围内，pcsk9随着温度升高其表达量总体呈现下调表达，30°C约为15°C的1/2 (图3)。在30°C高温胁迫0-3 h时间内，pcsk9表现为表达下调，表达量最小值O. 5出现在2 h (图4)。附图说明图I为常温下pcsk9基因在刺參各组织相对表达量，以体壁组织中基因的表达量作基准为I ;图2为高温胁迫后pcsk9在各组织相对表达量，常温下各组织中基因的表达量为基准I;图3为15°C -30°C范围内pcsk9相对表达量，以15°C条件下基因表达量作基准为I ;图4为30°C高温胁迫0-3 h时间内pcsk9相对表达量，以O h时间点基因的表达量为基准I。具体实施例方式下面对本专利技术做进ー步详细说明。I、刺參前蛋白转化酶枯草溶菌素9基因的克隆 选取体态结实，大小相似的6只刺參迅速放到30°C水槽中，作为高温处理组，另取6只刺參作为常温对照组，热应激3h后，取出刺參解剖取体壁、纵肌、消化道和呼吸树等组织，用Trizol (GIBC0L公司)提取总RNA;以DNaseI消化基因组污染，采用的Oligotex mRNA Kits (QIAGEN 公司)纯化 mRNA。米用 Clontech 公司提供的 PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit进行抑制性消减杂交，正向消减杂交即将高温组cDNA作为Tester,常温cDNA为Driver，反向消减杂交反之。消减后2次PCR的产物连接到载体pGEM-T easy (Promega),转化至E. coli DH5 α。正反向消减文库中各随机挑选384个阳性克隆，以32P dATP标记探针进行斑点杂交，筛选表达差异明显克隆进行测序分析，得到克隆号为SSHP3H7T7的下调表达基因刺參前蛋白转化酶枯草溶菌素9部分cDNA序列。根据获得序列设计RACE用基因特异性引物(5’ -ATGGTCACGGAACTCACTGTGCTGG ；5’ -CAATGATGGAGTCCCCGTGATCGTT)，利用 SMART RACE (Clontech 公司)试剂盒扩增得到刺參前蛋白转化酶枯草溶菌素9基因5’和3’端序列，进而拼接得到基因1338bp全长cDNA序列，如SEQ ID NO 1所示，其中l-31bp为5，非翻译区，1163_1338bp为3，非翻译区，开放阅读框为32-1162位核苷酸，编码376个氨基酸，如SEQ ID NO 2所示。2、刺參前蛋白转化酶枯草溶菌素9基因的表达特性以刺參看家基因β-actin为内參，采用实时荧光定量PCR技术，利用相对定量2_ΔΔα法对刺參前蛋白转化酶枯草溶菌素9基因在不同胁迫时间、不同温度下以及不同组织中的应激表达特性进行分析。不同组织高温30°C和常温15°C水槽中，处理3 h ;不同胁迫温度设定15、18、21、24、27、30°C 6个温度，高温胁迫3 h ;不同胁迫时间30°C的水槽中的刺參，分别在O、O. 5、1、1· 5、2、2. 5、3 h等7个时间点。各组分别取出6只刺參解剖取其等量体壁、纵肌、消化道和呼吸树等组织,在液氮中充分研磨，加入适量Trizol (Invitogen)提取总RNA,以DNase I (Promega)消化基因组污染，以Oligo nucleotide为反转录引物在M-MLV反转录酶(Promega)作用下转录合成单链cDNA。设计荧光定量PCR引物pcsk9,211bpF- TTCCATTGAACAACGGCTAC ； R-GGTGACTGATTTGGCGACAβ -actin, 262 bp F-CGGGAAATCGTTCGTGACA ； R-AGGACAAAGTTGGCGTACA在 ABI PRISM7300 FAST Real-Time PCR 扩增仪上进行，PCR 反应体系为SYBR Premix Ex TaqTM (2X) 10. 0 μ 1，上下游引物各 0. 4 μ I (IOmM), ROX ReferenceDye (50 X) 0. 4 μ 1，DNA 模板 2· O μ 1，加 dH20 至 20. O μ I。反应条件95°C 预变性 30s ;95°C变性5s，56°C退火30s，循环40次。pcsk9基因常温条件下在刺參各组织中均有表达，体壁中的表达量最闻，在呼吸树中表达量最少(图I);高温胁迫后pcsk9在各组织中均表现为下调表达，其中呼吸树中表达量变化最显著(图2)。在15°C -30°C范围内，pcsk9表现为下调表达，随着温度升高其表达量下降，pcsk9在30°C较27°C的表达量O. 54略微上升，但总体呈现下调表达(图3)。在30°C高温胁迫0-3 h时间内，pcsk9表现为表达下调，表达量最小值O. 5出现在2 h(图4)。pcsk9作为刺參高温胁迫后下调表达的ー种基因，是本是本研究首次发现的刺參新基因，其功能很可能与刺參脂类代谢的调节有关，其表达水平直接或间接影响酯酶的表达。pcsk9基因表达产物既有可能作为功能蛋白直接參与代谢调节，也有可能作为调节蛋白通过调控胁迫蛋白的表达及其蛋白质活性来提高刺本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种刺参高温胁迫应答基因，该基因是前蛋白转化酶枯草溶菌素9基因，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO:1所示，该基因的cDNA序列全长为1338bp，其中1？31为5’非翻译区，1163？1338为3’非翻译区，开放阅读框为32？1162位核苷酸，编码376个氨基酸。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙国华，杨建敏，任利华，郭婷婷，李雪艳，
申请(专利权)人：山东省海洋水产研究所，
类型：发明
国别省市：