一种快速鉴定象牙参与糙海参的方法技术

本发明专利技术公开了两种海参(象牙参Holothuria fuscopunctata与糙海参Holothuria scabra)的DNA条形码分子鉴定方法和其CO I序列，使用该方法进行PCR扩增出海参CO I基因，PCR产物经过琼脂糖胶进行验证后，进行测序，将测序结果与公开序列进行比对，如果与基因序列SEQ ID NO.1的同源性在99％以上，即可判断所述的待测组织即为象牙参来源；如果与基因序列SEQ ID NO.2的同源性在99％以上，即可判断所述的待测组织即为糙海参。本发明专利技术采用可靠的DNA分子鉴定技术，快速、准确的区分了象牙参与糙海参品种，增强了准确性和可靠性，确保海参作为药材入药的安全性。

【技术实现步骤摘要】
一种快速鉴定象牙参与糙海参的方法
本专利技术涉及物种鉴定领域，具体涉及2种海参(象牙参、糙海参)的DNA条形码分子鉴定方法。
技术介绍
海参为棘皮动物门(Echinodermata)海参纲(Holothrioider)动物的总称，是传统的海样食物和药物资源，具有抗肿瘤、降血脂、促进造血功能、提高免疫力、抗凝血等多种生物功效。不同海参品种价格差异较大，然而许多海参经济种类在贸易过程中缺乏清晰的种类鉴定。象牙参(Holothuriafuscopunctata)通常长6～30cm，宽0.8～10cm，全体表面灰白或黄白色，皱缩或具横纹，有的横向皱缩较深成槽沟状，沟处呈黄色或棕褐色。背中部色泽较深，两边较浅，腹面则逐渐变为白色；沿着腹面中央线常有一条明显的纵沟，腹面具有众多灰黑色点状疣足。其骨片多为扣状体，另有少量桌状体、穿孔板和杆状体等。糙海参(Holothuriascabra)体长30-40cm，宽8-10cm。口小，偏于腹面，具小形触手20个。肛门端位，周围有5组细疣。背面疣足小，而且数目不多；腹面管足呈疣足状，少而稀疏。背面和腹面交界处常有一行边缘腹侧疣。沿着腹面中央线常有一条明显的纵沟，加工后，这条沟仍很明显。体壁厚，骨片丰富，包括桌形体和扣状体。目前，传统的形态学鉴定方法非常容易受到物种本身在生长过程中环境、遗传等诸多因素的影响；且在加工炮制过程中形态被严重破坏或特征消失。因此，运用传统的形态学方法来鉴定海参品种变得非常困难，急需建立其他行之有效的方法来对市场海参品种进行快速鉴定。DNA条形码技术(DNABarcoding)是指生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。线粒体细胞色素C氧化酶1号基因(COI)是线粒体上一段蛋白质的编码基因，因其变异性大，易扩增是目前最常用的动物DNABarcoding。研究表明DNA条形码可以广泛应用于生物的分类和鉴定，是一种简便、高效、准确的物种鉴定技术，不仅可弥补传统鉴定方法的缺陷，还因其更客观、准确，突破对以往经验的依赖，能够鉴定物种、发现新种和隐种、重建物种等。运用DNA条形码技术，可以很好的对海参的品种进行快速、有效的鉴定。本专利技术提供一种快速鉴定象牙参与糙海参的方法，有利于实现象牙参与糙海参的快速准确鉴定，缩短鉴定时间。
技术实现思路
本专利技术克服目前以形态学鉴定海参方法存在的缺陷，提高象牙参与糙海参鉴定结果的准确度，是一种易于操作、灵敏度高的鉴定方法。本专利技术的技术方案如下：首先从采集的各种海参提取总DNA，利用一对引物进行PCR扩增一段COI基因片段，将扩增产物测序，然后进行序列分析比对，建立各种海参的序列标准数据库，在比较数据库DNA的基础上，通过分析在特定条件下的聚合酶链式反应的产物结果，从而达到快速，准确鉴定象牙参的目的。对需要鉴定的海参样品，提取其总DNA，在给定的条件下，用设计的特异引物进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳确定PCR扩增产物结果，然后测序，根据序列比对可以鉴别出象牙参与糙海参。本专利技术设计的用于鉴别象牙参与糙海参的分子鉴定方法，采用如下步骤：1、提取海参总DNA按海洋动物DNA提取试剂盒进行DNA提取，并用灭菌的去离子水将样品的DNA浓度稀释到50ng/μl。2、扩增DNA片段，进行聚合酶链式反应，即用特异的引物进行扩增，引物对序列为COIef2：5’-ATGATAGGAGCCCCAGAC-3’；COIer2：5’-TGGTTTACGCAATGGTAG-3’；扩增程序为94℃预变性2分钟94℃预变性30秒，48℃退火35秒，72℃延伸45秒，35个循环；72℃延伸7分钟。3、将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，使用DNAmarker检测PCR片段大小。4、鉴定结果的判断：若出现明显清晰的580bp大小的条带，且无杂带，则可送生物公司测序。5、将测序结果进行手工校对、序列拼接，如果与所述基因序列SEQIDNO.1同源性在99％以上，即可判断所述的待测组织即为象牙参；如果与所述基因序列SEQIDNO.2的同源性在99％以上，即可判断所述的待测组织即为糙海参。其中，所述的海参DNA条形码分子鉴定方法采用的是天根海洋动物DNA提取试剂盒。所述引物：正向引物为COIef2：5’-ATGATAGGAGCCCCAGAC-3’；反向引物为COIer2：5’-TGGTTTACGCAATGGTAG-3’所使用的DNA聚合酶为TAKARATaq酶。所述的电泳为1％-2％的琼脂糖凝胶电泳。所述的条带大小需要用DNAmaker检测。所述的DNA序列拼接软件包括CodonCodeAligner、Sequencher、Genious、DNAstar等软件。与传统的形态学鉴定方法相比，本专利技术获得的基因序列有利于实现象牙参与糙海参的分子鉴定。附图说明图1琼脂糖凝胶电泳，是用COI引物扩增海参的电泳检测图谱，其中泳道M为DNAMarker，泳道N1为阴性对照，泳道M1～M3为依次为样品M1，M2，M3。具体实施方式下面结合具体的实施例对本专利技术做进一步说明：实施例1：1、海参标本的采集：M1-象牙参干品；M2-糙海参干品；M3-随机市场收集海参样品2、试验样品的前处理：第一步，先将海参酒精保存样品中的酒精置换和干海参样品浸发，使用溶液均为PBS(137mmol/LNaCl，2.7mmol/LKCl，10mmol/LNa2HPO4，2mmol/LKH2PO4，pH7.2)第二步，取50-80mg经上步处理的样品，在800-1000μl高盐缓冲液(200mmol/LTris-HCl，50mmol/LEDTA，500mmol/LNaCl，0.2％β-巯基乙醇，pH8.0)中剪碎样品，10000-12000g/min离心1-2min，弃上清液；重复操作2次。蛋白酶K65℃温浴1小时，至组织完全溶解。加入等体积氯仿：异戊醇(24∶1)混匀，15，000×g室温离心10分钟，小心吸取上清至新的1.5mLEP管中。3、DNA模板制备：采用天根生物公司的海洋动物DNA提取试剂盒进行DNA提取，并用灭菌的去离子水将样品的DNA浓度稀释到50ng/μl。4、引物合成：本实施例所用引物如下：正向引物COIef2：5’-ATGATAGGAGCCCCAGAC-3’；反向引物COIer2：5’-TGGTTTACGCAATGGTAG-3’5、PCR扩增本实施例的PCR反应体系如下PCR反应体系为50μl：ddH2O37.6uL，10×PCRBuffer5uL，dNTP4uL，Taq酶0.4uL，正向引物/反向引物(10uM)各1uL，DNA模板1uL(50ng)扩增程序：为94℃预变性2分钟94℃预变性30秒，48℃退火35秒，72℃延伸45秒，35个循环；72℃延伸7分钟。6、琼脂糖电泳验证PCR结果琼脂糖电泳显示M1，M2，M3样品扩增良好，条带清晰无杂质，可直接送测序公司进行测序。7、测序结果序列拼接将测序结果用CodonCodeAligner生物软件，将序列导入，将引物剪切后将序列组装，然后跟SEQIDNO.1进行比对，M1与跟SEQIDNO.1同源率100％，为象牙参。M2与跟SEQIDNO.2同源率100％，为糙海参；M3序列与SEQIDNO.1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速鉴定象牙参与糙海参的方法，其特征在于：(1)鉴定象牙参(Holothuria fuscopunctata)与糙海参(Holothuria scabra)；(2)采用DNA条形码分子鉴定方法。

【技术特征摘要】
1.一种快速鉴定象牙参与糙海参的方法，其特征在于：(1)鉴定象牙参(Holothuriafuscopunctata)与糙海参(Holothuriascabra)；(2)采用DNA条形码分子鉴定方法。2.根据权利要求1所述的方法为DNA条形码分子鉴定方法，其步骤主要包括：(1)从待测的海参组织中分离提取总DNA；(2)以该DNA为模板用一对特异性引物，通过聚合酶链式反应扩增出海参COI基因；(3)然后取适量步骤(2)的聚合酶链式反应扩增出的COI基因产物用琼脂糖电泳分离鉴定扩增产物大小，将产物进行测序；(4)根据测序结果，进行分析比对，如果与基因序列SEQIDNO.1的同源性在99％以上，即可判断所述的待测组织即为象牙参来源；如果与基因序列SEQIDNO.2的同源性在99％以上，即可判断所述的待测组织即为糙海参来源。3.根据权利要求2所述的DNA条形码分子鉴定方法，其特征在于引物DNA的序列为：COIef2：5’-ATGATAGGAGCCCCAGAC-3’；COIer2：5’-TGGTTTACGCAATGGTAG-3’。4.根据权利要求2所述的DNA条形码分子鉴定方法，其特征在于所述聚合酶链式反应的扩增条件为94℃预变性2分钟94℃预变性30秒，48℃退火35秒，72℃延伸45秒，35个循环；72℃延伸7分钟。5.根据权利要求2所述的DNA条形码分子鉴定方法，其特征在于扩增产物的扩增片段为580bp，用1％-2％琼脂糖电泳检测。6.根据权利要求2所述的的DNA条形码分子鉴定方法，其特征在于所述的海参的DNA条形码标准检测基因序列为COI基因，具有如下所述的基因序列SEQIDNO.1：ATGATAGGAGCCCCAGACATGGCCTTCCCCCGGATGAAAAAAATGAGTTTCTGACTAGTTCCCCCTTCATTCATTCTTCTCCTAGCCTCAGCAGGCGTAGAAAGAGGAGCAGGCACAGGATGAACCATATACCCACCATTATCCAGAAACATTGCCCATGCTGGAGGGTCTGTTGACTTAGCTATTTTCTCTCTACACTTAGCCGGAGCCTCATCCATTCTAGCTTCTATAAACTTTATTACCACAATTATAAACATGCGGGCCCCAGGAATAACATTCGACCGTCTTCCTTTATTCGTATGATCAGTTTTCATCACAGCCTTCCTTCTCCTACTTAGGCTACCAGTTCTAGCAGGAGCCATAACAATGCTGCTAACAGACCGGAACATAAAAACAACATTTTTCGACCCCGCAGGAGGAGGAGACCCAATTCTATTCCAACATCTATTCTGATTCTTTGGCCATCCAGAAGTTTACATCCTAATCCTCCCAGGATTCGGAATGATATCACATGTAATAGCTCACTACAGAGGCAAGCAAGAGCCCTTTGGATATCTCGGAATGGTTTACGCAATGGTAG。7.根据权利要求2所述的的DNA条形码分子鉴定方法，其特征在于所述的海参的DNA条形码标准检测基因序列为COI基因，具有如下所述的基因序列SEQIDNO.2：ATGATAGGAGCCCCAGACATGGCCTTCCCACGCATGAAAAAAATGAGTTTCTGATTAGTCCCTCCCTCTTTTATTTTACTTCTTGCCTCAGCCGGAGTAGAAAGCGGTGTAGGAACAGGCTGAACAATCTATCCTCCCCTCTCCAGAAACATAGCCCATGCAGGAGGTTCCGTTGACCTAGCCATTTTTTCACTTCACCTAGCAGGAGCTTCCTCAATCCTAGCCTCCATAAATTTTATAACTACCATTATAAACATGCGAACCC...

【专利技术属性】
技术研发人员：李振国，陈艳明，务勇圣，郭晓璐，
申请(专利权)人：牡丹江友搏药业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23