一种具有杀菌活性的仿刺参肽聚糖识别蛋白及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于分子生物学领域和基因工程技术领域，具体公开了一种具有杀菌活性的仿刺参肽聚糖识别蛋白及其制备方法和应用。本发明专利技术利用体外重组表达技术首次获得了仿刺参肽聚糖识别蛋白AJ‑PGRP，仿刺参肽聚糖识别蛋白(AJ‑PGRP)为序列表SEQ ID NO.1中氨基酸序列所示。该重组蛋白对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有凝集作用，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、灿烂弧菌和枯草芽孢杆菌具有抑制作用，在开发新型广谱抗菌药物开发和饲料添加剂等方面具有潜在应用价值。

Sea cucumber peptidoglycan identification protein with bactericidal activity, preparation method and application thereof

The invention belongs to the field of molecular biology and the technical field of gene engineering, and specifically discloses a sea cucumber peptidoglycan identification protein with bactericidal activity, a preparation method and an application thereof. The invention uses the expression obtained for the first time in Apostichopus japonicus peptidoglycan recognition protein AJ recombinant PGRP in vitro, Apostichopus japonicus peptidoglycan recognition protein (AJ PGRP) shows the amino acid sequence of SEQ ID sequence list NO.1. The recombinant protein has agglutination effects on Staphylococcus aureus and Escherichia coli, has inhibitory effect on Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Vibrio splendidus and Bacillus subtilis, which has potential value in the development of new antibacterial drug development and feed additive etc..

【技术实现步骤摘要】
一种具有杀菌活性的仿刺参肽聚糖识别蛋白及其制备方法和应用
本专利技术属于分子生物学领域和基因工程
，具体涉及一种具有杀菌活性的仿刺参肽聚糖识别蛋白及其制备方法和应用。
技术介绍
仿刺参(Apostichopusjaponicus)属棘皮动物门(Echinodermata)，海参纲(Holothuroidea)，楯手目(Aspidochirotida)，刺参科(Stichopodidae)，主要分布在北纬35°～44°的西北太平洋沿岸，山东、辽宁和河北是我国仿刺参的主要养殖区。仿刺参位列“海八珍”之首，具有很高的营养价值和医药价值。近年来，随着人们社会生活条件的提高和健康意识的增强，仿刺参市场需求量逐年增加，不断刺激养殖规模加大，仿刺参因此成为我国水产养殖业中单一产值最大的养殖品种。但是养殖过程中遇到的病害问题一直是困扰产业进一步发展的重要制约因素。利用生物技术的手段进行疾病防治越来越引起人们的重视。肽聚糖(Peptidoglycan)是存在于革兰氏阳性和阴性细菌细胞壁中的一种复合糖类。主链是β-1,4-糖苷键连接的N-乙酰氨基葡糖和N-乙酰胞壁酸交替的杂多糖。肽聚糖是许多细菌细胞壁的主要成分，尤其在革兰氏阳性细菌中，其所含的肽聚糖占细胞壁干重的50～80％。肽聚糖识别蛋白(Peptidoglycanrecognitionprotein,PGRP)是识别和结合肽聚糖的模式识别分子。通过识别入侵菌原菌的肽聚糖，进而激活Toll信号通路(Toll-likereceptors)途径和免疫缺陷(ImmuneDeficiency,IMD)途径等免疫信号通路并介导吞噬作用，因此在抵抗病原入侵的过程中发挥着重要的作用。1996年，YoshidaH首次在家蚕血淋巴中发现肽聚糖识别蛋白，随后在鱼类、软件动物和一些脊椎动物中也相继被发现。根据它们的序列结构特点，肽聚糖识别蛋白可以分为两个亚型，即长型肽聚糖识别蛋白(PGRP-L)和短型肽聚糖识别蛋白(PGRP-S)。而目前对于仿刺参肽聚糖识别蛋白尚未有报道。发掘仿刺参的功能基因，制备生物抗菌药物，有助于解决当前养殖中抗生素抗药性问题，因此具有十分重要的理论和现实意义。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本申请提供一种具有杀菌活性的仿刺参肽聚糖识别蛋白的制备及应用。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种具有杀菌活性的仿刺参肽聚糖识别蛋白，仿刺参肽聚糖识别蛋白(AJ-PGRP)为序列表SEQIDNO.1中氨基酸序列所示。肽聚糖识别蛋白(AJ-PGRP)的制备方法为：(1)以仿刺参cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增，待用；(2)PCR产物经纯化后与载体pEASY-E1载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌，测序鉴定重组子；(3)将上述表达载体pEASY-AJ-PGRP转入TransBL21(DE3)化学感受态细胞，筛选转化子，将转化子接种于含有氨苄青霉素的LB培养基中，用IPTG诱导表达，而后用亲和层析柱纯化重组蛋白，即得到序列表SEQIDNo.1中氨基酸序列的肽聚糖识别蛋白AJ-PGRP。所述引物分别为：F1：5’-ATGGATGAACCGCCGCGTGCCTT-3’，R1:5’-ATGGTGATGTATAATTTCTTG-3’。本专利技术还公开了仿刺参肽聚糖识别蛋白的应用，所述序列表SEQIDNO.1中氨基酸序列的AJ-PGRP用于制备广谱抗菌类制剂或饲料添加剂。本专利技术还公开了所述仿刺参肽聚糖识别蛋白用于制备抗金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、灿烂弧菌和枯草芽孢杆菌的制剂。本专利技术具有的优点：本专利技术利用体外重组表达技术首次获得了仿刺参肽聚糖识别蛋白AJ-PGRP，该重组蛋白对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有凝集作用，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、灿烂弧菌和枯草芽孢杆菌具有抑制作用，在开发新型广谱抗菌药物开发和饲料添加剂等方面具有潜在应用价值。本专利技术获得的仿刺参肽聚糖识别蛋白AJ-PGRP对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌具有凝集作用，同时对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌具有明显抑制作用，在开发新型广谱抗菌药物开发和饲料添加剂等方面具有潜在应用价值。附图说明图1为SDS-PAGE检测到的蛋白表达图，其中1为诱导表达的目的蛋白，2为MARKER；图2为本专利技术实施例提供的对细菌的凝集作用图；图3为本专利技术实施例提供的抑菌活性图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。实施例1：仿刺参AJ-PGRP编码区的原核重组表达，具体步骤如下：1.原核重组表达载体的构建本专利技术采用北京全式金生物技术(TransGenBiotech)有限公司的pEASY-E1原核表达载体。利用特异性引物PCR扩增AJ-PGRP的全部编码区。PCR反应程序设置为：①94℃预变性4min，②94℃变性30s；③52℃复性30s；④72℃延伸1min。⑤72℃终延伸10min。将步骤②③④进行40个循环。将PCR产物进行纯化回收，与pEASY-E1载体连接。连接产物转化大肠杆菌TransBL21(DE3)，挑选5～10个单个菌落接种于LB液体培养基，并送测序公司测序，以验证阅读框的正确性，所述特异性引物分别为：F1：5’-ATGGATGAACCGCCGCGTGCCTT-3’，R1:5’-ATGGTGATGTATAATTTCTTG-3’。重组蛋白的表达：将验证正确的菌株接种于50mL的LB液体培养基，置于振荡培养箱中，37℃200rpm中培养12～16小时，然后将此培养液以1:100的比例接种于新LB的200mL液体培养基中，37℃培养至OD600＝0.8。加入IPTG，使之终浓度达到1mM，18℃继续培养10小时。使用His.Bind树脂纯化重组蛋白，pH梯度下洗脱，即可得到序列表SEQIDNO.1中氨基酸序列的蛋白。SEQIDNO.1MDEPPRAFPITLVVLGIILAMSCADKSAYAKTDAACPVIVSRSDWQAKPPKNRTDMATPVPFVILHHTLWDECYDFESCCAEMRKIQDFHQGNRSWDDIGYNFCVGQDGRIYEGRGWDTVGAHAPWYNLRSIGICIMGNFTVKLPNQKSVDAVSSLIKCAIEENKLKDSYILYGHRQVRDTGCPGDALFKEIQSWPHWKPGQHYPPNQSKPVSQQEIIHHH序列特征：长度：221个氨基酸类型：氨基酸链型：单链拓扑结构：线型特征：分子量为25.07kDa，等电点为6.54，具有一个保守的PGRP结构域。来源：仿刺参实施例2：仿刺参AJ-PGRP编码区的原核重组蛋白的细菌凝集活性分析对枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(G+菌)和灿烂弧菌(Vibriosplendidus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)(G-菌)的凝集实验将枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌接种到LB液体培养基中，37℃培养至OD值至0.6，灿烂弧菌采用TCBS培养基在25℃培养至OD值至0.6，然后用生理盐水稀释至OD值为0.001，然后5000rpm离心10分钟收集菌体沉淀，用含10mMZnCL2的TBS缓冲液洗本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有杀菌活性的仿刺参肽聚糖识别蛋白，其特征在于，所述仿刺参肽聚糖识别蛋白AJ‑PGRP为序列表SEQ ID NO.1中氨基酸序列所示。

【技术特征摘要】
1.一种具有杀菌活性的仿刺参肽聚糖识别蛋白，其特征在于，所述仿刺参肽聚糖识别蛋白AJ-PGRP为序列表SEQIDNO.1中氨基酸序列所示。2.如权利要求1所述的一种肽聚糖识别蛋白AJ-PGRP的制备方法，其特征在于，制备方法如下：(1)以仿刺参cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增，待用；(2)PCR产物经纯化后与载体pEASY-E1载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌，测序鉴定重组子；(3)将表达载体pEASY-AJ-PGRP转入TransBL21(DE3)化学感受态细胞，筛选转化子，将转化子接种于含有氨苄青霉素的LB培养基中，用IPTG诱导表达，而后用亲和层析柱纯化重组蛋白，即得到序列表SEQID...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔令明，丛海燕，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东,37