肽的重组产生制造技术

本发明专利技术涉及重复自组装前体蛋白质、编码其的核酸序列及表达构建体、及使用此类前体蛋白质重组产生肽的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】肽的重组产生本专利技术涉及重复自组装前体蛋白质、编码其的核酸序列及表达构建体、及通过使用此类前体蛋白质重组产生肽的方法。
技术介绍
存在不同已知方法通过生物技术手段来产生肽。因为短的多肽链在微生物宿主细胞中之稳定性通常较低，且因为此类游离肽可对宿主生物产生可能毒性作用(例如抗微生物肽)，所以大多数方法包含产生较大前体蛋白质，在纯化前体蛋白质之后自该前体蛋白质切除肽。获得稳定前体蛋白质之一可能性包含借助于融合蛋白质表达肽以及稳定蛋白质。该融合蛋白质之性质极大地影响后续处理步骤，其由基本上与肽序列无关之融合配偶体决定，且因此可易于控制且适于产生具有不同序列之肽。 WO 2008/085543描述一种借助于融合蛋白质产生蛋白质及肽之特殊方法。此融合蛋白质除所需肽序列以外亦包含融合配偶体，该融合配偶体确保融合蛋白质具有逆相变行为。此行为首先涉及以简单且廉价之方式自细胞环境中纯化融合蛋白质。其次，在已通过蛋白质裂解将肽移除之后，同样可以简单且廉价之方式移除该融合配偶体。虽然融合蛋白质常可以优良产率获得，但前体蛋白质之肽部分通常较小，且因此此过程之效率并非最佳。另一方法涉及重复前体蛋白质，其包含重组产生之所需肽的多个拷贝。W003/089455描述多聚前体蛋白质之产生，通过酸裂解自此类多聚前体蛋白质中切除具有抗微生物性质之所需肽序列。存在许多其他公开方法(实例Metlitskaya等人，Biotechnol Appl. Biochem39；339-345(2004) ;Wang及Cai Appl. Biochem and Biotechnol. 141 ;203_213 (2007))，其用于证明肽序列或肽序列家族可通过特定方法借助于重复前体蛋白质来产生。在某种程度上，已描述位于所需肽序列之重复序列之间的特点辅助序列之用途。更具体地，已提出阴离子辅助序列，其明显减少重复前体蛋白质内之阳离子抗微生物肽序列对宿主细胞之有害作用(参看例如WO 00/31279及US 2003/0219854)。虽然此重复方法中之前体蛋白质的所需肽序列比例比融合蛋白质之情况高，但所需阳离子肽序列极大地影响此类重复前体蛋白质之性质。本专利技术人并不了解涉及根据可以有效方式进行之简单且低成本方案借助于重复前体蛋白质产生任何肽序列之可能性的任何先前方法。各种抗微生物肽已描述于文献中且概括于评述中(Hancock, R. E. W.及Lehrer,R. 1998,Trends in Biotechnology, 16 :82-88 ；Hancock,R. E. ff.及 Sahl,H. G. 2006, NatureBiotechnology,24 :1551-1557)。文献中亦描述组合两种活性肽之融合肽。Wade等人报导刻克罗普斯蚕蛾(Hyalophora cecropia)杀菌肽(cecropin)A与毒性蜂毒肽之各种融合物的抗菌作用(Wade, D.等人·，1992, International Journal of Peptide and Protein Research, 40:429-436)。Shin等人描述由20个氨基酸组成的刻克罗普斯蚕蛾杀菌肽A与光滑爪蟾(Xenopus Iaevis)爪蟾抗菌肽(magainin) 2之融合肽的抗菌作用。杀菌肽A由37个氨基酸组成且显示出其对抗革兰氏阴性细菌(Gram-negative bacteria)之活性低于对抗革兰氏阳性细菌之活性。爪蟾抗菌肽2由23个氨基酸组成且对细菌以及肿瘤细胞系具有活性。与天蚕抗菌肽A与蜂毒肽之融合物相比，此融合物显示在可比抗菌作用下明显较低之溶血活性(Shin, S. Y. Kang, J. H. , Lee, Μ. Κ. , Kim, S. Y. , Kim, Y. , Hahm, K. S. , 1998, Biochemistryand Molecular Biology International，44 :1119-1126)。US 2003/0096745 Al 及 US6，800, 727 B2要求保护由20个氨基酸组成之此等融合肽，及因氨基酸取代、尤其带正电荷氨基酸及疏水性氨基酸之取代而带更多正电荷且疏水性更强的该融合物之变体。Shin等人,1999描述此天蚕抗菌肽A-爪蟾抗菌肽2融合肽之进一步发展。他们证明具有SEQ ID NO :6之肽的溶血活性比起始融合物低，但其对大肠杆菌(Escherichiacoli)及枯草杆菌(Bacillus subtilis)之抗菌活性未受到不利影响(Shin等人，1999Journal of Peptide Research, 53 :82_90)。专利技术简述因此，本专利技术之一目标为提供一种借助于重复前体蛋白质产生肽之广泛适用方 法。通过一种经由生物技术手段产生肽之新颖方法来实现此目标，其中以可预期方式产生包含高比例所需肽序列且包含控制前体蛋白质性质之辅助序列的重复前体蛋白质。该方法可用于产生不同肽序列而无需针对不同肽序列之每一者在根本上重建使前体分子表达之条件或后续处理程序。此外，可能产生出先前所用方法无效率产生之肽。附图简述图I描绘借助于投影α螺旋结构获得之氨基酸序列之螺旋轮表示。重复前体蛋白质中所包含之氨基酸序列Α1-Α7 (A)描绘于环(B)上。此排列显现出α-螺旋中氨基酸之位置图2描绘在酸裂解之后肽“ΖηΟ”之逆相层析图；图3描绘在酸裂解及反相HPLC之后“ΖηΟ”肽之质谱；所示数值表示特定单同位素峰之m/z值；图4描绘在酸裂解及阳离子交换层析之后肽“P18”之反相层析图；图5描绘在酸裂解、阳离子交换层析及反相HPLC之后“P18”肽之质谱；所示数值指示特定单同位素峰之m/z值；图6描绘在酸裂解之后肽“Min”之反相层析图；图7描绘在酸裂解及反相HPLC之后“Min”肽之质谱；所示数值指示特定单同位素峰之m/z值；图8描绘在酸裂解及阳离子交换层析之后肽SEQ ID NO 6之反相层析图；图9描绘在酸裂解、阳离子交换层析及反相HPLC之后肽SEQ ID NO 6之质谱；所示数值为具体单同位素峰之m/z值；附图说明图10描绘在根据实施例6进行酰胺化之前及之后肽“P18”之HPLC阳离子交换层析图；出于比较之目的，展示具有肽“P18”序列之以化学方式合成且酰胺化之参考肽的层析图；图11描绘在根据实施例7进行酰胺化之前及之后肽“P18”之HPLC阳离子交换层析图；出于比较之目的，展示具有肽“P18”序列之以化学方式合成且酰胺化之参考肽的层析图。优选实施方案本专利技术尤其涉及以下实施方案I. 一种合成、尤其重组产生之前体蛋白质，其包含所需肽(Pep)组件与辅助肽(Aux)组件之重复单元的以酶促及/或化学方式可裂解之重复序列，通式如下(Pep-Aux) x 或(Aux-Pep)X其中X >1，其中 此类Aux组件为相同或不同的且包含赋予该前体蛋白质自组装性质之氨基酸序列组件；且此类Pep组件为相同或不同的且包含相同或不同肽分子之氨基酸序列。2.如实施方案I之前体蛋白质，其中此类组件Pep与Aux直接或经由可裂解之肽序列以肽键连接彼此，且该肽键可以化学方式或酶促方式特异性裂解，亦即，仅仅或主要在确定氨基酸位置本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.06.03 EP 09161837.11.一种前体蛋白质，其包含所需肽(Pep)组件及辅助肽(Aux)组件的可裂解重复序列，具有通式 (Pep-Aux)x或(Aux-Pep)x 其中X > 1，其中 此类Aux组件为相同或不同的且包含赋予所述前体蛋白质自组装性质的氨基酸序列组件 '及 此类Pep组件为相同或不同的且包含相同或不同肽分子的氨基酸序列。2.根据权利要求I的前体蛋白质，其中所述组件Pep与Aux以肽键连接彼此且该肽键可依化学方式或酶促方式特异性裂解。3.根据前述权利要求中任一项的前体蛋白质，其形成稳定缔合物，此类稳定缔合物在室温下不能在I小时内由O. 2M NaOH溶解或在10分钟内由2M尿素或IM盐酸胍溶解。4.根据前述权利要求中任一项的前体蛋白质，其中至少一个Aux组件包含自组装肽(SA)组件，该自组装肽(SA)组件包含至少一个具有至少8个氨基酸的序列，该序列包含至少50%丙氨酸残基、至少50%缬氨酸残基或至少50%谷氨酰胺残基，或至少80%的该序列由这些残基中的至少一个组成。5.根据权利要求4的前体蛋白质，其中所述SA组件包含至少一个以下序列基序 K(基序1) (GA)m (基序 2) Vn(基序3) (VA)m (基序 4) (VVAA)0 (基序 5) 其中A为丙氨酸,G为甘氨酸,V为缴氨酸,η为2至12的整数,m为2至10的整数,且ο为I至6的整数。6.根据权利要求4或5的前体蛋白质，其中所述SA组件包含选自氨基酸序列SEQIDNO :1至SEQ ID NO :5及SEQ ID NO 73的氨基酸序列。7.根据前述权利要求中任一项的前体蛋白质，其中至少一个Aux肽另外包含保护性肽(SU)组件。8.根据权利要求7的前体蛋白质，其中所述SU组件具有比例增加的带负电荷的氨基酸残基。9.根据权利要求8的前体蛋白质，其中所述前体蛋白质中的所述SU组件能够形成两亲 性螺旋结构。10.根据权利要求9的前体蛋白质，其中所述SU组件为两亲性肽，其包含能够形成两亲性α -螺旋的至少七个以肽键连接的氨基酸的序列区段，其中所述螺旋的氨基酸残基在垂直投影中分为该螺旋的疏水性半部及亲水性半部，该螺旋的疏水性半部具有至少3个相邻(在该垂直投影中)的相同或不同的疏水性氨基酸残基，且该螺旋的亲水性半部具有至少3个相邻(在该垂直投影中)的相同或不同的亲水性氨基酸残基。11.根据权利要求8、9或10的前体蛋白质，其中选择所述SU组件的带电氨基酸残基的比例，使得在PH = 7下该前体蛋白质的总净电荷大于-10且小于+10。12.根据权利要求8至11中任一项的前体蛋白质，其中所述SU组件包含选自氨基酸序列 SEQ ID NO : 16 至 SEQ ID NO : 19 及 SEQ ID NO 68 的氨基酸序列。13.根据前述权利要求中任一项的前体蛋白质，其中所述Pep组件包含阳离子抗微生物肽序列。14.根据权利要求13的前体蛋白质，其中所述Pep组件包含选自阳离子氨基酸序列SEQID NO 6 至 SEQ ID NO : 15、SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 26 及 SEQ ID NO 69 至 SEQ ID NO 72的氨基酸序列。15.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·许梅里希，B·利布曼，M·费尔，C·施瓦尔布，H·布吕泽，
申请(专利权)人：巴斯夫欧洲公司，
类型：发明
国别省市：