重组人那希力肽的生产方法技术

本发明专利技术涉及一种生物活性多肽重组人那希力肽的生产方法，该方法包括以下步骤：ａ．人工合成人那希力肽氨基酸编码区相对应的基因；ｂ．步骤ａ得到的基因与适宜的表达载体上的细菌硫氧还蛋白基因３′端融合，中间含肠激酶或者凝血酶识别位点；ｃ．将含有步骤ｂ得到的融合蛋白编码基因的表达载体转化适宜的大肠杆菌获得基因工程菌；ｄ．该基因工程菌经发酵后，经提取，层析，纯化步骤，制备出人那希力肽－硫氧还蛋白融合蛋白；ｅ．步骤ｄ得到的融合蛋白经肠激酶或者凝血酶切割后，分离，纯化，获得重组人那希力肽。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种生物活性多肽的制备方法，特别涉及一种利用基因重组技术制备那希力肽的生物活性多肽的方法。
技术介绍
那希力肽(Nesiritide)又称脑钠素(Brain Natreuritic Peptide，BNP)，是由脑组织和心脏合成和分泌的生物活性物质。Sudoh等首先从猪脑中分离出那希力肽，随后发现其他动物和人心脏中也有那希力肽的分布，脑细胞中合成的那希力肽作为神经递质发挥生理功能；心肌细胞合成并分泌至血液循环中的那希力肽则作为心脏的内分泌物，对调节心血管功能和水盐代谢起重要作用。心力衰竭时血浆BNP含量增加，静脉滴注外源性BNP可以进一步改善心力衰竭时的心肾功能。因此，重组人那希力肽在临床上具有重要的使用价值。根据文献报道，人那希力肽(hBNP)由32个氨基酸残基所组成，其氨基酸序列如下Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly-Cys-Phe-Gly-Arg-Lys-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Ser-Ser-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Lys-Val-Leu-Arg-Arg-His，其中第10位和第26位Cys残基内的巯基形成分子内的二硫键。中国专利99120613.4公布了一种制备人那希力肽的方法，该方法采用的是串联表达技术，既将BNP串联成十聚体直接克隆到表达载体pET22a上。表达产物经柱层析纯化后，串联的BNP融合蛋白用色氨酸裂解试剂裂解为单个BNP，经柱层析纯化后，再将BNP单体中二硫键氧化生成二硫键，最后用梭肽酶Y去掉BNP C末端多余的色氨酸得到与天然人序列完全一致的BNP。该工艺步骤极其繁杂，且容易在BNP二硫键生成时形成分子间的聚合体或异构体，得率极低。本专利技术大大简化了工艺，大大提高了那希利肽产量，从而可大规模工业化生产人那希力肽。
技术实现思路
本专利技术提供一种制备人那希力肽的方法，该方法包括以下步骤 a.人工合成人编码那希力肽氨基酸序列的基因DNA片段；b.步骤a得到的基因片段与适宜的表达载体上的细菌硫氧还蛋白基因3′端融合，中间含肠激酶或者凝血酶识别位点；c.将含有步骤b.得到克隆的融合蛋白编码基因的表达载体重组质粒DNA转化适宜的大肠杆菌获得基因工程菌；d.该基因工程菌经发酵后，经提取，层析，纯化步骤，制备出人那希力肽-硫氧还蛋白融合蛋白；e.步骤d得到的融合蛋白经肠激酶或者凝血酶切割后，分离，纯化，获得重组人那希力肽。步骤d.中的融合蛋白中硫氧还蛋白和人那希力肽之间通过肠激酶酶切识别位点-(Asp)n-Lys-连接，结构为X-(Asp)n-Lys-hBNP，其中X为硫氧还蛋白，Asp为天冬氨酸(简写为D)，Lys为赖氨酸(简写为K)，hBNP为人那希力肽，n为2、3或者4，即表示n个Asp串联在一起Asp。或融合蛋白中硫氧还蛋白和人那希力肽之间通过凝血酶酶切识别位点X-P2-P3-Pro-P1.连接，结构为X-P2-P3-Pro-P1_hBNP，其中X为硫氧还蛋白，P1为Arg或Lys，P2、P3为疏水性氨基酸选自Leu、Val、ILe、Met、Ala、Cys或Trp，这里P2可以优选但不限于Leu，P3可以优选但不限于Val，X-P2-P3-Pro-P1_hBNP代表的优选的氨基酸序列可以但不限于为X-Leu-Val-Pro-Arg-hBNP。所述人那希力肽-硫氧还蛋白融合蛋白的编码DNA和氨基酸序列见序列表序列表1为那希力肽-硫氧还蛋白融合蛋白(肠激酶识别序列为DDDDY)的编码DNA序列。序列表2为那希力肽-硫氧还蛋白融合蛋白(肠激酶识别序列为DDDDY)的氨基酸序列。序列表3为那希力肽-硫氧还蛋白融合蛋白(肠激酶识别序列为DDDY)的编码DNA序列。序列表4为那希力肽-硫氧还蛋白融合蛋白(肠激酶识别序列为DDDY)的氨基酸序列。序列表5为那希力肽-硫氧还蛋白融合蛋白(肠激酶识别序列为DDY)的编码DNA序列。序列表6为那希力肽-硫氧还蛋白融合蛋白(肠激酶识别序列为DDY)的氨基酸序列。序列表7为那希力肽-硫氧还蛋白融合蛋白(凝血酶识别序列)的编码DNA序列。序列表8为那希力肽-硫氧还蛋白融合蛋白(凝血酶识别序列)的氨基酸序列。本专利技术的制备方法，其特征在于，其中所述发酵是将合格的重组人那希力肽基因工程菌接种到发酵罐中培养，其中加入IPTG诱导融合蛋白的表达。本专利技术的制备方法，其中所述提取层析纯化，对于肠激酶识别位点的融合蛋白包括的步骤为离心收集菌体，破菌、离心收集破菌液上清的步骤，将收集的上清上Zn2+-Sepharose F.F.金属离子螯和柱，用平衡缓冲液洗去杂蛋白，然后用含适宜浓度的咪唑洗脱那希力肽-硫氧还蛋白融合蛋白，将洗脱的那希力肽-硫氧还蛋白融合蛋白用透析或超滤除去咪唑，用高纯度的Enterkinase做酶切处理，将酶切的融合蛋白上Zn2+-Sepharose F.F.柱去掉硫氧还蛋白，将得到的那希力肽上反相柱层析，用含TFA的Acetonitrile梯度洗脱，得到纯度95％以上的纯那希力肽。对于凝血酶识别位点的融合蛋白包括的步骤为离心收集菌体，破菌、离心收集破菌液沉淀(Thioredoxin-BNP融合蛋白主要在离心沉淀中)。将收集的沉淀清用8M的脲素溶解，然后用透析的方法去掉脲素，将透析液直接用凝血酶(Thrombin)酶切，将酶切的溶液直接上SP-Sepharose F.F.离子交换柱，rhBNP被吸附在柱上，其它大部分杂质则直接穿透；将洗脱的含rhBNP的溶液上反相柱层析，用含TFA的Acetonitrile梯度洗脱，可得到纯度95％以上的纯品。用适宜的方法去掉乙氰和三氟乙酸，并换成适宜的缓冲液，如柠檬酸盐缓或磷酸盐缓冲液。本专利技术还提供人那希力肽药物组合物，其配方组成如下那希力肽 0.5mg甘露醇 5～20mg 柠檬酸(一水) 2.1mg柠檬钠(二水) 2.94mg或那希力肽 0.5mg甘露醇 5～20mg磷酸二氢钠 0.93mg磷酸氢二钠 1.73mg氯化钠 10mg本专利技术是根据已经发表的人那希力肽一级结构的氨基酸编码序列(该序列可按照遗传密码的通用性、简并性和大肠杆菌对遗传密码使用的偏好性原则进行改变)，人工合成该双链DNA全序列。本专利技术的主要特点在于，分别将该编码基因片段克隆入适宜表达载体，(优选的如pET32a或pTDa，为常规的表达载体，均可在市场上买到，内含硫氧还蛋白基因片段)中构建形成重组质粒，然后将重组质粒转化适宜的大肠杆菌，经过筛选，优选的为BL21(λDE3)或HB101菌株(为常规菌株，均可在市场上买到)。该基因工程菌以硫氧还蛋白(Thioredoxin)为融合伴侣，融合表达hBNP，即形成那希力肽-硫氧还蛋白融合蛋白，所表达的融合蛋白经过适宜的步骤分离纯化后，用适宜的具有特异序列识别能力的蛋白酶如用肠激酶(Enterkinase)或凝血酶(Thrombin)将hBNP从融合蛋白上切割下来，经过高度分离纯化，得到hBNP纯品。经过N-末端氨基酸序列测定、质谱分子量测定、等电点测定、肽图分析以及生物活性检测等分析，结果表明我们所表达的人那希力肽与天然的那希力肽各指标完全一致，而表达效率为全菌蛋白的30％以上，高于现有技术报道的串联法生本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人那希力肽的制备办法，包括以下步骤：ａ．人工合成人那希力肽氨基酸编码区相对应的基因；ｂ．步骤ａ得到的基因与表达载体上的细菌硫氧还蛋白基因３′端融合，中间含肠激酶或者凝血酶识别位点；ｃ．将含有步骤ｂ的克隆有融合蛋白 编码基因的表达载体重组质粒ＤＮＡ转化大肠杆菌获得基因工程菌；ｄ．该基因工程菌发酵后，经提取，层析，纯化步骤，制备出那希力肽－硫氧还蛋白融合蛋白；ｅ．步骤ｄ的融合蛋白，经肠激酶或者凝血酶切割后，经分离，纯化，得人那希力肽。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：周裕程，赵斌，彭宏卫，杨伟，彭辉，
申请(专利权)人：成都西玛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：90[中国|成都]