番茄长链非编码RNA-lncRNA23468及其克隆方法与应用方法技术

本发明专利技术提供了一种通过沉默miRNA482b来提高番茄晚疫病抗性的长链非编码RNA‑lncRNA23468，其DNA分子序列如SEQ ID NO.1所示；提供了该长链非编码RNA的克隆方法：以野生型抗晚疫病番茄L3708的cDNA为模板进行PCR扩增，将得到的PCR产物与pMD‑19T克隆载体连接，转化大肠杆菌DH5α，挑取单菌落进行测序；还提供了该长链非编码RNA的应用方法。本发明专利技术方法得到的长链非编码RNA在番茄中瞬时过表达后，番茄miR482b的表达量显著降低，对晚疫病的抗性显著提高；其用于沉默miR482b，对培育抗晚疫病番茄品种具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
番茄长链非编码RNA-lncRNA23468及其克隆方法与应用方法
本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及一个番茄长链非编码RNA-lncRNA23468的克隆及应用。
技术介绍
长链非编码RNA(lncRNAs)是一类长度在200nt以上的不含有编码序列(CDS)的RNA，其大量存在于植物体内并具有多种生物学功能。近年来，随着组学技术的快速发展，lncRNAs在拟南芥、玉米、水稻、小麦、棉花、番茄、黄瓜、杨树等植物中被鉴定出来。研究发现，植物的lncRNAs在花期调控、光形态发生等发育过程和生物及非生物胁迫响应中起着重要的调控作用。在植物和病原物互作过程中，4个小麦lncRNAs响应条锈病菌的侵染；一些拟南芥的lncRNAs受镰刀菌诱导；部分番茄lncRNAs在番茄与番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)互作过程中发挥着重要作用。microRNA(miRNA)是一类长约22nt的内源性、非编码RNA，其可以通过与靶基因的mRNA互补配对在转录后水平抑制基因的表达，从而调控植物的生长发育和对生物及非生物胁迫的反应。近年来的研究发现，lncRNAs与miRNA间存在着交叉调节作用。一方面，与miRNA的互作会降低lncRNA的稳定性；另一方面，lncRNAs可以诱捕miRNA，提高被miRNA抑制的靶mRNA的表达。在番茄与TYLCV互作的过程中，lncRNA-Slylnc0195可以作为内源性的模拟靶标结合miR166来保护其靶标classIIIHD-Zip转录因子mRNA。MiR482在番茄、葡萄、小麦等多种植物中广泛存在，并在这些植物的防御反应中起着重要的调控作用。在马铃薯纺锤块茎类病毒、黄瓜花叶病毒、大豆胞囊线虫、黄萎病菌等病原物侵染后，番茄、大豆、马铃薯、棉花等植物中的miR482的表达量显著下降。之前的研究表明，miR482可以靶向NBS-LRR类抗性基因并通过裂解其转录本调控其表达，从而参与植物的防御反应。miR482-NBS-LRR在植物与病原物互作过程中有重要作用。在马铃薯中的研究发现，过表达miR482e的植株，靶基因NBS-LRR的表达量显著下降，对黄萎病菌的易感性增加，进一步验证了miR482-NBS-LRR在植物抗病中的重要作用。番茄是一种世界范围内广泛种植的经济、园艺作物。在其生长过程中，由各种病原物引起的病害，严重影响了番茄的产量，造成了巨大的经济损失。近年来，晚疫病已成为最严重的番茄病害之一，对农业生产及经济发展危害极大。虽然化学农药对晚疫病的发生和蔓延有一定的控制作用，但由此引发的环境污染、病原菌抗药性等问题，依旧给农业生产带来了极大的困扰。因此，研究番茄抗病的分子机制，用生物学方法提高番茄对晚疫病的抗性迫在眉睫。
技术实现思路
本专利技术的目的在于开发一种克隆番茄长链非编码RNA-lncRNA23468的方法；并提供该基因在沉默miRNA482b及增强番茄对晚疫病抗性中的应用。为了达到上述目的，本专利技术提供了一种番茄长链非编码RNA-lncRNA23468，其序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术还提供了上述番茄长链非编码RNA-lncRNA23468的克隆方法，以野生型抗晚疫病番茄L3708的cDNA为模板，以lncRNA23468-FP、lncRNA23468-RP为特异性引物，进行PCR扩增；所述的特异性引物lncRNA23468-FP、lncRNA23468-RP序列分别如SEQIDNO.2、SEQIDNO.3所示；克隆所用特异性引物具体如下：lncRNA23468-FP：CGGGATCCAAAAATAAAAGAAAGCTTGCACG，lncRNA23468-RP：CGAGCTCGGACCGGATAATGAAGATGGT；将得到的PCR产物与pMD-19T克隆载体连接，得到的连接产物转化大肠杆菌DH5α并涂布在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上，挑取单菌落进行测序，所得结果如SEQIDNO.1所示。本专利技术还提供了番茄长链非编码RNA-lncRNA23468的应用方法，用于沉默番茄miR482b。优选方式下，上述番茄长链非编码RNA-lncRNA23468提高番茄对晚疫病的抗性。具体通过以下技术方案实现：将含有番茄长链非编码RNA-lncRNA23468的重组表达载体转化农杆菌GV3101并涂布在含有卡那霉素、链霉素及利福平的YEB固体培养基上，挑取单菌落进行菌液PCR验证；选取阳性工程菌瞬时侵染番茄叶片，并检测叶片中miR482b的表达量及叶片对晚疫病的抗性。本专利技术的目的植物为双子叶植物番茄。优选方式下，所述重组载体由番茄长链非编码RNA-lncRNA23468插入表达载体得到。进一步优化，所述重组载体的具体制备方法为：①克隆番茄长链非编码RNA-lncRNA23468：以野生型抗晚疫病番茄L3708的cDNA为模板、以lncRNA23468-FP和lncRNA23468-RP为特异性引物进行PCR扩增；所述特异性引物的序列分别如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示；将得到的产物与pMD-19T克隆载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α并涂布在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上，挑取单菌落进行测序。②构建含有番茄长链非编码RNA-lncRNA23468的重组表达载体：提取上述含有番茄长链非编码RNA-lncRNA23468菌体中的质粒，用限制性内切酶BamHI及SacI双酶切，回收得到的目的片段，将其与去除GUS基因的pBI121表达载体连接，连接产物即为重组表达载体。③验证表达载体：将上述连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂布在含有卡那霉素的LB固体培养基上，挑取单菌落进行PCR及双酶切验证。本专利技术的技术创新在于：1、本专利技术克隆得到了一个番茄长链非编码RNA-lncRNA23468；构建了含有番茄长链非编码RNA-lncRNA23468的表达载体；证明了长链非编码RNA-lncRNA23468对miR482b的沉默作用。2、本专利技术明确了长链非编码RNA-lncRNA23468可以通过沉默致病相关的非编码RNAmiR482b来增强番茄对晚疫病的抗性。过表达本专利技术得到的lncRNA23468后，番茄miR482b的表达量显著下降，植株抗晚疫病效果更优，对培育抗晚疫病番茄品种具有重要意义。附图说明图1为瞬时过表达lncRNA23468与对照组叶片中lncRNA23468的表达量；图2为瞬时过表达lncRNA23468与对照组叶片中miR482b的表达量；图3为晚疫病菌处理5天后瞬时过表达lncRNA23468与对照组叶片表型。具体实施方式以下结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。实施例中未注明的实验条件及方法，均为常规方法。实施例一：番茄长链非编码RNA-lncRNA23468的克隆1.番茄总RNA的提取(1)将样品放入研钵中，加入液氮充分研磨至粉末。(2)取适量粉末，置于1.5mLRNase/DNaseFree离心管中，同时迅速加入1mL预冷的Trizol，摇匀，室温静置5min。(3)向离心管中加入200μL氯仿，摇匀，室温静置5min，4℃12000r/min离心15min。(4)将上清转移至新离心管中，加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，-20℃静置20min后，4℃本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种番茄长链非编码RNA‑lncRNA23468，其特征在于，其DNA分子序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种番茄长链非编码RNA-lncRNA23468，其特征在于，其DNA分子序列如SEQIDNO.1所示。2.权利要求1所述番茄长链非编码RNA-lncRNA23468的克隆方法，其特征在于：以野生型抗晚疫病番茄L3708的cDNA为模板，以lncRNA23468-FP、lncRNA23468-RP为特异性引物，进行PCR扩增；所述特异性引物的序列分别如SEQIDNO.2、SEQIDNO.3所示；将得到的PCR产物与pMD-19T克隆载体连接，得到的连接产物转化大肠杆菌DH5α并涂布在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上，挑取单菌落进行测序，所得产物即为番茄长链非编码RNA-lncRNA23468。3.权利要求1所述番茄长链非编码RNA-lncRNA23468的应用方法，其特征在于，用于沉默番茄miR482b。4.根据权利要求3所述番茄长链非编码RNA-lncRNA23468的应用方法，其特征在于，用于提高番茄对晚疫病的抗性。5.根据权利要求3或4所述番茄长链非编码RNA-lncRNA23468的应用方法，其特征在于，通过以下技术方案实现：将含有番茄长链非编码RNA-lncRNA23468的重组表达载体转化农杆菌GV3101并涂布在含有卡那霉素、链霉素及利福平的YEB固体培养基上，挑取单菌落进行菌液PCR验证；选取阳性工程菌瞬时...

【专利技术属性】
技术研发人员：栾雨时，姜宁，崔军，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21