一种特异性靶向变异链球菌gtfB位点的CRISPR-B基因编辑方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种特异性靶向变异链球菌

【技术实现步骤摘要】
一种特异性靶向变异链球菌gtfB位点的CRISPR-B基因编辑方法及应用
本专利技术涉及基因序列，具体涉及一种特异性靶向变异链球菌gtfB位点的CRISPR-B基因编辑方法及应用。
技术介绍
龋病是人类常见的口腔疾病之一，是由致龋微生物代谢产酸所导致的慢性感染性疾病(PetersenPE,KwanS.WorldHealthOrganizationglobaloralhealthstrategiesfororalhealthpromotionanddiseasepreventioninthetwenty-firstcentury[J].PrventionUndGesundheitsfrderung,2009,4(2):100-104.)；变异链球菌(Streptococcusmutans)是目前世界公认的致龋微生物之一，其致龋特性主要体现在以下几个方面：较强的产酸和耐酸能力、较强的环境适应能力、合成细胞外不可溶性多糖(Extracellularpolysaccharide，EPS)以及对牙齿表面较强的粘附能力等；其中，合成胞外不可溶性多糖及粘附能力是变异链球菌区别于其它致龋性微生物的主要特征(MarshPD.Microbiologyofdentalplaquebiofilmsandtheirroleinoralhealthandcaries[J].DentalClinicsofNorthAmerica,2010,54(3):441-54.)；同时，由变异链球菌合成的大量胞外不可溶性多糖还可以为牙菌斑生物膜中其它致龋微生物提供粘附位点，形成协同致龋效应；因此，如何有效抑制变异链球菌的过度生长，控制牙菌斑系统的生态平衡成为预防龋病的主要难点，而如何有选择性地有效抑制变异链球菌的生物膜形成能力，尤其是胞外多糖合成能力则成为了上述难点中的关键问题。葡萄糖基转移酶(Glucosyltransferase，Gtfs)是变异链球菌重要的毒力因子；变异链球菌利用其Gtfs代谢碳水化合物产生胞外多糖，在口腔细菌对牙面的粘附及生物膜形成方面具有重要作用；相关研究表明，变异链球菌中gtfB、gtfC和gtfD基因(分别编码GtfB、GtfC和GtfD蛋白质，简称Gtfs)与合成胞外多糖密切相关，其中gtfB是合成胞外不可溶性多糖最主要的基因；当把Gtfs敲除后，会影响胞外基质与生物膜的形成，从而使变异链球菌生物膜形成功能不全(KooH,XiaoJ,KleinMI,etal.ExopolysaccharidesProducedbyGlucosyltransferasesModulatetheEstablishmentofMicrocolonieswithinMultispeciesBiofilms[J].)；这一研究结果提示，如果通过外源性手段特异性抑制变异链球菌Gtfs，控制胞外多糖的合成，可抑制口腔生物膜形成。截至目前，抑制变异链球菌Gtfs活性的方法大多是通过体外加入某些天然有机化合物或者无机化合物等小分子，如：黄酮类、喹喔啉亚胺类和氟化物等(RenZ,ChenL,LiJ,etal.InhibitionofStreptococcusmutanspolysaccharidesynthesisbymoleculestargetingglycosyltransferaseactivity[J].JournalofOralMicrobiology,2016,8(1):31095.)；尽管它们能够很好的抑制Gtfs的活性，但仍然存在一些不足：第一，筛选的盲目性，不能高效准确的找到特异性强的小分子；第二，其具体的作用机理大多尚不清楚，没有进行系统的阐释；第三，某些小分子虽有很强的抑制作用，具体有没有副作用还不得而知；第四，某些小分子的提纯或合成成本昂贵，步骤繁琐；第五，某些化合物虽然来自于天然药物，是否会埋下潜在的毒性也尚未报道；第六，小分子的本身的物理化学属性(如溶解度，作用时间等)是否有利于抑制Gtfs活性等等；此外，也有利用传统的基因敲除方法敲除gtfB、gtfC或gtfD，虽然也能达到抑制效果，但存在效率低、步骤繁琐和特异性差等缺点；因此，综合以上原因，亟需寻找一种新的策略来弥补当前技术的不足。CRISPR(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats)，简称CRISPR系统，大约40％的细菌和90％的古细菌拥有CRISPR系统，它是细菌为应对病毒或质粒不断攻击演化而来的获得性免疫防御机制(MakarovaKS,HaftDH,BarrangouR,etal.EvolutionandclassificationoftheCRISPR-Cassystems.[J].NatureReviewsMicrobiology,2011,9(6):467-77.)；其中，目前研究和应用较多的一种是II-A型：CRISPR/Cas9。II-A型CRISPR/Cas9系统基因座结构包括：5'端tracrRNA(trans-activatingCRISPRRNA)基因，它主要是与成熟的crRNA结合形成复合体，指导Cas9蛋白特异性切割外源DNA；中间是一系列Cas蛋白编码基因(包括Cas9、Cas1、Cas2和Csn2)，主要发挥核酸酶剪切作用；以及3'端的CRISPR基因座：由启动子区域、大量间隔序列(spacers)和重复序列(directrepeats)顺序构成，其中间隔序列(spacers)是来自病毒或质粒的DNA；此外，前间区序列邻近基序(protospaceradjacentmotif,PAM：NGG)的主要功能是帮助Cas9能够精确区分需要进行降解的非自身DNA和序列完全相同的自身DNA，从而实现特异靶向切割(JinekM,ChylinskiK,FonfaraI,etal.AProgrammableDual-RNA–GuidedDNAEndonucleaseinAdaptiveBacterialImmunity[J].Science,2012,337(6096):816.)；因此，当细菌再次遭遇外源DNA的入侵时，CRISPR基因座就会转录产生tracrRNA和crRNA，并与Cas9结合形成最小功能复合体，进而crRNA将特异性指导Cas9靶向剪切清除外源DNA；然而，在龋病微生物研究中，尤其是变异链球菌的基因编辑中，该技术仍然处于起步阶段。
技术实现思路
本专利技术提供一种与变异链球菌胞外多糖合成有关的特异性靶向变异链球菌gtfB位点的CRISPR基因序列(以下简称：CRISPR-B)、基因编辑方法及应用。本专利技术采用的技术方案是：一种特异性靶向变异链球菌gtfB位点的CRISPR基因序列，所述基因序列如SEQIDNO.1所示。一种采用特异性靶向gtfB基因位点的CRISPR-B基因序列的基因编辑方法，包括以下步骤：步骤1：在基因序列前连接乳酸脱氢酶启动子Ldhp，形成Ldhp+CRISPR-B；步骤2：通过酶切和连接将Ldhp+CRISPR-B连接到线性质粒pDL278，形成CRISPR编辑载体；步骤3：通过聚合酶链式反应扩增敲除目的基因gtfB上游序列作为upst本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种特异性靶向变异链球菌gtfB位点的CRISPR基因序列，其特征在于，所述基因序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种特异性靶向变异链球菌gtfB位点的CRISPR基因序列，其特征在于，所述基因序列如SEQIDNO.1所示。2.一种采用如权利要求1所述特异性靶向变异链球菌gtfB位点的CRISPR-B基因序列的基因编辑方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：在基因序列前连接乳酸脱氢酶启动子Ldhp，形成Ldhp+CRISPR-B；步骤2：通过酶切和连接将Ldhp+CRISPR-B连接到线性质粒pDL278，形成CRISPR编辑载体；步骤3：通过聚合酶链式反应扩增敲除目的基因gtfB上游序列作为upstream；步骤4：通过聚合酶链式反应扩增敲除目的基因gtfC下游序列作为downstream；步骤5：将步骤3得到的upstream和步骤4得到的downstream连接形成同源重组模板HR-BC；步骤6：将步骤2得到的CRISPR编辑载体和步骤5得到的同源重组模板HR-BC转入变异链球菌中，即可实现同时编辑gtfB和gtfC。3.一种如权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：李雨庆，龚涛，彭显，王诗达，周学东，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川,51