用于检测花生DNA的特异性引物和探针及实时荧光定量PCR试剂盒制造技术

本发明专利技术提供用于检测花生DNA的特异性引物和探针，所述探针序列为：5’‑AAGTCATCAGCAGCCACGGAA‑3’；所述特异性引物为下述序列或为下述序列的互补链序列：上游引物序列为5’‑ATCCTCGTTGTGTCTATGA‑3’；下游引物序列为5’‑TGTTCCCCACTCTTGTTCT‑3’。本发明专利技术还提供相应的实时荧光定量PCR试剂盒。本发明专利技术的特异性引物和探针以及相应试剂盒能够用于花生的实时荧光定量PCR检测，且所建立的方法具有高敏感性和高特异性，能够从花生、胡麻、玉米、大豆、土豆、芝麻、油菜、核桃、葵花、橄榄等多种油料作物中特异性鉴别花生油。

【技术实现步骤摘要】
用于检测花生DNA的特异性引物和探针及实时荧光定量PCR试剂盒
本专利技术属于分子生物学和体外诊断试剂
，具体涉及用于检测花生DNA的特异性引物和探针以及实时荧光定量PCR试剂盒。
技术介绍
检测食用油DNA质量的基因主要有叶绿体ATP、RBCL基因和物种特异性基因。叶绿体是植物细胞重要的细胞器，叶绿体DNA被广泛用于系统进化的研究。叶绿体基因具有高度的保守型，而其中rbcL基因正是由于其进化特点而被广泛用于植物系统发生的研究。它的一些编码区在进化过程中速率较慢，比较保守，而一些非编码区在不同的物种间进化速度却比较快，具有一定的种间差异性和种内保守性，因而适合进行物种鉴别。通过对rbcL基因上一段序列进行通用引物设计，可以对不同的物种同时进行扩增，且同时具有种间差异性，在不同的物种之间差异比较大，易于进行物种鉴别。叶绿体基因在多数植物中以多拷贝形式存在，所以对于DNA含量甚微的精炼食用油，比单拷贝或少拷贝的物种特异性基因具有更高灵敏度的优势。物种特异性参照基因需要满足以下2个条件：该作物所有品种都存在该基因；其他生物没有或不存在扩增该基因的特异靶序列。通过建立物种特异性PCR方法来检测食品加工品中的该物种，逐渐成为食品质量检测的重要手段。PCR检测鉴定技术通常以内参基因(內源参照基因)为靶标，内参基因是具有植物物种专一性且拷贝数恒定、不显示等位基因变化的保守DNA序列，可用于对基因组中某一目的基因进行定量分析。因为内参基因的拷贝数恒定，不会收到种植环境、栽培措施等因素的影响，所以对于该物种的所有栽培品种都能够以该基因作为靶标进行PCR检测，通过内参基因的拷贝数来计算待测样本的数量。实时荧光定量PCR(FluorescencequantitativePCR)技术从常规PCR定性检测迈上量化的台阶，它相对常规PCR技术先进、操作简便、利用实时荧光定量PCR技术能够实现实时监测、绝对定量和快速检测的目的，同时具有具有灵敏度高、特异性好、操作便捷等优点，因此非常适合临床检测。实时荧光定量PCR技术有很多分支，其定量方式也不同，主要分为荧光染料嵌入技术、荧光探针技术和自身淬灭荧光技术等。荧光染料嵌入技术是利用SYBRgreenI嵌入DNA双链是荧光强度增加的特性，将荧光信号引入双链DNA，该方法特异性较差，结果常受到引物二聚体的存在的干扰而导致假阳性等问题，因此不适合用于食品快检。而荧光探针技术如Taqman技术、分子信标技术等因为其特异性比荧光染料嵌入技术和自身淬灭荧光技术要好，因此更适合食品检验使用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于设计一组植物源性食用油花生的特异性引物和探针序列，建立一种能广泛应用于食品检验的快速、灵敏、特异性好的用荧光定量PCR检测方法。本专利技术采用基因克隆技术，将花生的Arah1基因片段插入到载体pMD18-T中，获得含有花生Arah1DNA基因片段的重组质粒，以此作为标准品。根据花生的Arah1DNA的基因片段编码基因序列设计并合成一组特异性引物和探针，优化PCR反应条件，建立以实时荧光定量聚合酶链反应为平台的检测方法，并对所建立的方法进行评估。。针对目前市场上频繁出现的食用油掺假行为，本专利技术以常见的油料作物花生为研究对象，结合常规PCR、实时荧光PCR，研究建立油料作物花生和食用花生油的实时荧光探针PCR方法，旨在构建快速、简便、准确和高效的常见食用油掺假分子生物学鉴别技术体系，为食用油质量监管和控制提供科学手段。运用分子生物学技术对食用油进行掺假检测，首要前提是从油脂中提取出适合PCR扩增的DNA。由于精炼食用油生产需经过高温及高压等处理，其中的DNA降解为大小不一的碎片，且含量极低，这给DNA提取造成了很大困难。因而DNA提取技术成为食用油PCR检测技术的瓶颈，是食用油检测成功与否的关键所在。本专利技术采用分子生物学相关技术，开展食用油品种鉴别技术研究，将为食用油产品的质量安全管理提供科学手段，有利于国内食用油市场的规范、高端食用油进出口贸易的顺利进行和整个食用油行业的健康发展。通过对花生Arah1序列对比，并对其进行Blast对比及特异性分析，结果表明，本专利技术设计的引物序列为花生物种特异性序列。该花生特异性引物的扩增长度为278bp，而扩增片段大小和扩增基因组成对PCR扩增精炼食用油DNA很重要。扩增片段越小，PCR扩增成功率越高，且GC含量高的DNA在加工工程中更稳定，内源基因比外源基因在加工过程中更稳定。所以PCR扩增食用油DNA应该选择片段小且GC含量高的基因组片段。本专利技术的第一个目的是提供用于检测花生DNA的特异性引物和探针，所述探针序列为：5’-AAGTCATCAGCAGCCACGGAA-3’；所述特异性引物为下述序列或为下述序列的互补链序列：上游引物序列为5’-ATCCTCGTTGTGTCTATGA-3’；下游引物序列为5’-TGTTCCCCACTCTTGTTCT-3’。作为优选，探针中5’端标记的荧光报告基团为FAM、TET、JOE、HEX、VIC中的一种，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMRA、DABCYL、BHQ中的一种。作为优选，所述上游引物和所述下游引物为向5’端和3’端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列。本专利技术的第二个目的是提供一种用于检测花生DNA的实时荧光定量PCR试剂盒，所述实时荧光定量PCR试剂盒包括权利要求1-3任一项所述的特异性引物和探针。作为优选，在10μlPCR反应体系中，所述上游引物的用量为0.1μl，所述下游引物的用量为0.1μl，所述探针的用量为0.2μl。作为优选，所述实时荧光定量PCR试剂盒还包括系列浓度标准品和阳性对照；所述系列浓度标准品是将花生Arah1rDNA基因与载体连接，转化至感受态细胞中诱导表达，提取重组质粒，将重组质粒定量后稀释，得到系列浓度标准品。作为优选，所述标准品的核苷酸序列为序列表中序列1。本专利技术的第三个目的是提供上述的特异性引物和探针、实时荧光定量PCR试剂盒在如下任一中的应用：(1)定性或定量检测或辅助检测花生DNA；(2)制备定性或定量检测或辅助检测花生DNA的产品；(3)定性或定量检测或辅助检测植物油中是否含有花生油；(4)制备定性或定量检测或辅助检测植物油中是否含有花生油的产品。本专利技术的第四个目的是提供一种检测或辅助检测植物油中是否含有花生油的方法，分别以系列浓度标准品和待测样品DNA为模板，利用特异性引物和探针进行实时荧光定量PCR，绘制标准曲线，通过标准曲线和待测样品的Ct值判定结果。作为优选，所述实时荧光定量PCR的反应条件为：94℃预变性2分钟，94℃15秒、60℃40s并收集荧光信号，40个循环。本专利技术提供用于对花生油进行定性、定量检测的引物和探针，通过提取待检测样品中的DNA，再结合实时荧光定量PCR检测技术，可达到准确定量检测待测标本中花生油DNA含量的目的。本专利技术所提供的引物和探针可用于科研及食品检验中对花生油DNA进行定性、定量分析，有利于开展食用油品种鉴别技术研究，将为食用油产品的质量安全管理提供科学手段，有利于国内食用油市场的规范、高端食用油进出口贸易的顺利进行和整个食用油行业的健康发展。下面结合附图以及具体实施方案对本专利技术做更详细阐述。附图说明附图用来提本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测花生DNA的特异性引物和探针，其特征在于：所述探针序列为：5’‑AAGTCATCAGCAGCCACGGAA‑3’；所述特异性引物为下述序列或为下述序列的互补链序列：上游引物序列为5’‑ATCCTCGTTGTGTCTATGA‑3’；下游引物序列为5’‑TGTTCCCCACTCTTGTTCT‑3’。

【技术特征摘要】
1.用于检测花生DNA的特异性引物和探针，其特征在于：所述探针序列为：5’-AAGTCATCAGCAGCCACGGAA-3’；所述特异性引物为下述序列或为下述序列的互补链序列：上游引物序列为5’-ATCCTCGTTGTGTCTATGA-3’；下游引物序列为5’-TGTTCCCCACTCTTGTTCT-3’。2.根据权利要求1所述的特异性引物和探针，其特征在于：探针中5’端标记的荧光报告基团为FAM、TET、JOE、HEX、VIC中的一种，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMRA、DABCYL、BHQ中的一种。3.根据权利要求1所述的特异性引物和探针，其特征在于：所述上游引物和所述下游引物为向5’端和3’端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列。4.一种用于检测花生DNA的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述实时荧光定量PCR试剂盒包括权利要求1-3任一项所述的特异性引物和探针。5.根据权利要求4所述的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：在10μlPCR反应体系中，所述上游引物的用量为0.1μl，所述下游引物的用量为0.1μl，所述探针的用量为0.2μl。6.根据权利要求4或5所述的实时荧光定...

【专利技术属性】
技术研发人员：张镭，徐红，刘宇琴，车团结，沈颂东，陈游，石文，李亚鹏，
申请(专利权)人：苏州百源基因技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32