一种全基因组甲基化高通量测序方法技术

本发明专利技术公开了一种全基因组甲基化高通量测序方法，包括如下步骤：将基因组测序样本，连接上CCGG位点的接头，随后用MmeI酶切，在用连接酶连接上基因组测序样本上的第二个接头，将扩增后的基因组测序样本使用PTP平板，且测序模板表面放置有ATP硫化酶以及荧光素酶，测序开始时，A、T、C、G四种碱基依照固定顺序依次循环进行入PTP平板，在ATP硫化酶的作用下，生成的PPi和磷酰硫酸结合形成ATP，在荧光素酶的催化下，生成的ATP和荧光素结合形成氧化荧光素，在反应所释放的光信号被高灵敏度的CCD捕获，并生成测序图像。本发明专利技术能够对基因组进行准确的测序，能够将基因组序列显示在我们眼前。

A whole genome methylation high flux sequencing method

The present invention discloses a complete genome methylation high flux sequencing method, including the following steps: the genome sequencing sample, the joint on the CCGG site, then the MmeI enzyme cut, the second joints on the genome sequencing sample connected with the ligase, and the amplified genomic sequencing sample using the PTP plate and the test. ATP vulcanase and luciferase were placed on the surface of the sequence template. At the beginning of sequencing, the four bases of A, T, C and G circulated into the PTP plate in sequence according to the fixed order. Under the action of ATP vulcanase, the formed PPi and phosphonyl sulphuric acid were combined to form ATP. Under the catalysis of luciferase, the formation of ATP and fluorescein formed oxidation. Fluorescein, the light signal released in the reaction is captured by a highly sensitive CCD and generates sequenced images. The invention can accurately sequence the genome and display the genome sequence before us.

【技术实现步骤摘要】
一种全基因组甲基化高通量测序方法
本专利技术涉及基因测序
，尤其涉及一种全基因组甲基化高通量测序方法。
技术介绍
高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，因此在有些文献中称其为下一代测序技术(nextgenerationsequencing)足见其划时代的改变，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序。根据发展历史、影响力、测序原理和技术不同等，主要有以下几种：大规模平行签名测序(MassivelyParallelSignatureSequencing,MPSS)、聚合酶克隆(PolonySequencing)、454焦磷酸测序(454pyrosequencing)、Illumina(Solexa)sequencing、ABISOLiDsequencing、离子半导体测序(Ionsemiconductorsequencing)、DNA纳米球测序(DNAnanoballsequencing)等。随着现在科技的不断进步，现有的测序方法已经满足不了现在的发展速度。为此，我们提出了一种全基因组甲基化高通量测序方法。
技术实现思路
本专利技术提出了一种全基因组甲基化高通量测序方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。本专利技术提出了一种全基因组甲基化高通量测序方法，包括如下步骤：S1：选取基因组，并利用限制性内切酶对基因组进行酶切，以便获得基因组片段，并将获取的基因组片段置于零下15-零下8摄氏度的条件下进行放置，放置环境需为无菌环境；S2：在放置36-48h后，将基因组片段取出，并置于5-8摄氏度的环境中，然后将所述基因组片段进行末端修复，以便获得经过末端修复的基因组片段，修复后的基因组片段再次放置在器皿内，并向器皿内添加亚硫酸盐，且亚硫酸盐需漫过基因组片段，并对基因组片段进行实时晃动，从而使其均匀接触，待其放置4-7min后，则完成对基因组片段的修饰，从而形成基因组测序样本；S3：将S2中形成的基因组测序样本，对样本上的CCGG位点进行确定，然后连接上CCGG位点的接头，随后用MmeI酶切，可得到一段包含HpaII酶切位点的18-19bp的标签序列，在用连接酶连接上基因组测序样本上的第二个接头，然后对其进行扩增，且扩增的温度为25-35摄氏度；S4：将S3中扩增后的基因组测序样本使用PTP平板，且PTP平板含有160万个光纤孔，在测序反应中，每个光纤孔内都固定有测序模板，且测序模板表面放置有ATP硫化酶以及荧光素酶，测序开始时，A、T、C、G四种碱基依照固定顺序依次循环进行入PTP平板，且每次只进入一个碱基，在ATP硫化酶的作用下，生成的PPi和磷酰硫酸结合形成ATP，在荧光素酶的催化下，生成的ATP和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光；S5：在S4中反应所释放的光信号被高灵敏度的CCD捕获，并生成测序图像，从而获得待测模板的测序信息。优选的，在S2中的修饰过程中，必须保证pH值的准确度。优选的，在S3中的扩增具体步骤如下：将基因组测序样本利用微乳液PCR在固定有扩增引物的微球表面上延伸待测模板，扩增时，每个液滴就相当于一个扩增反应器，并包括一个微球、一条模板以及扩增酶，扩增完成时，成功扩增的微球表面存在2*107-5*107个克隆。优选的，在S5中待测模板需完全被聚合为双链。优选的，在S2中对基因组片段进行末端修复前，需要预先对基因组片段进行纯化，以保证基因组片段的干净度。本专利技术提出的一种全基因组甲基化高通量测序方法，有益效果在于：该全基因组甲基化高通量测序方法能够对基因组进行准确的测序，在测序前，能够对基因组进行多次预处理，从而有效保证了测序的效率以及质量，通过多种酶的使用，能够将基因组序列显示在我们眼前，符合现在发展的需求。具体实施方式下面结合具体实施例来对本专利技术做进一步说明。实施例1本专利技术提出了一种全基因组甲基化高通量测序方法，包括如下步骤：S1：选取基因组，并利用限制性内切酶对基因组进行酶切，以便获得基因组片段，并将获取的基因组片段置于零下15摄氏度的条件下进行放置，放置环境需为无菌环境；S2：在放置36h后，将基因组片段取出，并置于5摄氏度的环境中，然后将所述基因组片段进行末端修复，以便获得经过末端修复的基因组片段，修复后的基因组片段再次放置在器皿内，并向器皿内添加亚硫酸盐，且亚硫酸盐需漫过基因组片段，并对基因组片段进行实时晃动，从而使其均匀接触，待其放置4min后，则完成对基因组片段的修饰，从而形成基因组测序样本；S3：将S2中形成的基因组测序样本，对样本上的CCGG位点进行确定，然后连接上CCGG位点的接头，随后用MmeI酶切，可得到一段包含HpaII酶切位点的18-19bp的标签序列，在用连接酶连接上基因组测序样本上的第二个接头，然后对其进行扩增，且扩增的温度为25摄氏度；S4：将S3中扩增后的基因组测序样本使用PTP平板，且PTP平板含有160万个光纤孔，在测序反应中，每个光纤孔内都固定有测序模板，且测序模板表面放置有ATP硫化酶以及荧光素酶，测序开始时，A、T、C、G四种碱基依照固定顺序依次循环进行入PTP平板，且每次只进入一个碱基，在ATP硫化酶的作用下，生成的PPi和磷酰硫酸结合形成ATP，在荧光素酶的催化下，生成的ATP和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光；S5：在S4中反应所释放的光信号被高灵敏度的CCD捕获，并生成测序图像，从而获得待测模板的测序信息。在S2中的修饰过程中，必须保证pH值的准确度。在S3中的扩增具体步骤如下：将基因组测序样本利用微乳液PCR在固定有扩增引物的微球表面上延伸待测模板，扩增时，每个液滴就相当于一个扩增反应器，并包括一个微球、一条模板以及扩增酶，扩增完成时，成功扩增的微球表面存在2*107个克隆。在S5中待测模板需完全被聚合为双链。在S2中对基因组片段进行末端修复前，需要预先对基因组片段进行纯化，以保证基因组片段的干净度。实施例2本专利技术提出了一种全基因组甲基化高通量测序方法，包括如下步骤：S1：选取基因组，并利用限制性内切酶对基因组进行酶切，以便获得基因组片段，并将获取的基因组片段置于零下13摄氏度的条件下进行放置，放置环境需为无菌环境；S2：在放置38h后，将基因组片段取出，并置于6摄氏度的环境中，然后将所述基因组片段进行末端修复，以便获得经过末端修复的基因组片段，修复后的基因组片段再次放置在器皿内，并向器皿内添加亚硫酸盐，且亚硫酸盐需漫过基因组片段，并对基因组片段进行实时晃动，从而使其均匀接触，待其放置5min后，则完成对基因组片段的修饰，从而形成基因组测序样本；S3：将S2中形成的基因组测序样本，对样本上的CCGG位点进行确定，然后连接上CCGG位点的接头，随后用MmeI酶切，可得到一段包含HpaII酶切位点的18-19bp的标签序列，在用连接酶连接上基因组测序样本上的第二个接头，然后对其进行扩增，且扩增的温度为28摄氏度；S4：将S3中扩增后的基因组测序样本使用PTP平板，且PTP平板含有160万个光纤孔，在测序反应中，每个光纤孔内都固定有测序模板，且测序模板表面放置有ATP硫化酶以及荧光素酶，测序开始时，A、T、C、G四种碱基依本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种全基因组甲基化高通量测序方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：选取基因组，并利用限制性内切酶对基因组进行酶切，以便获得基因组片段，并将获取的基因组片段置于零下15‑零下8摄氏度的条件下进行放置，放置环境需为无菌环境；S2：在放置36‑48h后，将基因组片段取出，并置于5‑8摄氏度的环境中，然后将所述基因组片段进行末端修复，以便获得经过末端修复的基因组片段，修复后的基因组片段再次放置在器皿内，并向器皿内添加亚硫酸盐，且亚硫酸盐需漫过基因组片段，并对基因组片段进行实时晃动，从而使其均匀接触，待其放置4‑7min后，则完成对基因组片段的修饰，从而形成基因组测序样本；S3：将S2中形成的基因组测序样本，对样本上的CCGG位点进行确定，然后连接上CCGG位点的接头，随后用MmeI酶切，可得到一段包含HpaII酶切位点的18‑19bp的标签序列，在用连接酶连接上基因组测序样本上的第二个接头，然后对其进行扩增，且扩增的温度为25‑35摄氏度；S4：将S3中扩增后的基因组测序样本使用PTP平板，且PTP平板含有160万个光纤孔，在测序反应中，每个光纤孔内都固定有测序模板，且测序模板表面放置有ATP硫化酶以及荧光素酶，测序开始时，A、T、C、G四种碱基依照固定顺序依次循环进行入PTP平板，且每次只进入一个碱基，在ATP硫化酶的作用下，生成的PPi和磷酰硫酸结合形成ATP，在荧光素酶的催化下，生成的ATP和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光；S5：在S4中反应所释放的光信号被高灵敏度的CCD捕获，并生成测序图像，从而获得待测模板的测序信息。...

【技术特征摘要】
1.一种全基因组甲基化高通量测序方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：选取基因组，并利用限制性内切酶对基因组进行酶切，以便获得基因组片段，并将获取的基因组片段置于零下15-零下8摄氏度的条件下进行放置，放置环境需为无菌环境；S2：在放置36-48h后，将基因组片段取出，并置于5-8摄氏度的环境中，然后将所述基因组片段进行末端修复，以便获得经过末端修复的基因组片段，修复后的基因组片段再次放置在器皿内，并向器皿内添加亚硫酸盐，且亚硫酸盐需漫过基因组片段，并对基因组片段进行实时晃动，从而使其均匀接触，待其放置4-7min后，则完成对基因组片段的修饰，从而形成基因组测序样本；S3：将S2中形成的基因组测序样本，对样本上的CCGG位点进行确定，然后连接上CCGG位点的接头，随后用MmeI酶切，可得到一段包含HpaII酶切位点的18-19bp的标签序列，在用连接酶连接上基因组测序样本上的第二个接头，然后对其进行扩增，且扩增的温度为25-35摄氏度；S4：将S3中扩增后的基因组测序样本使用PTP平板，且PTP平板含有160万个光纤孔，在测序反应中，每个光纤孔内都固定有测序模板，且测序模板表面放置有ATP硫化酶以及荧光素酶，测...

【专利技术属性】
技术研发人员：李泽卿，
申请(专利权)人：武汉爱基百客生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42