一种乙酰胆碱酯酶固定化载体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种乙酰胆碱酯酶固定化载体，其特征在于，所述固定化载体的结构表示为Fe3O4@SiO2‑NH2，其包括球状尖晶石结构的磁性Fe3O4纳米粒子，粒径大小为15‑20 nm，包覆于所述磁性Fe3O4纳米粒子表面的二氧化硅，以及修饰于Fe3O4@SiO2纳米粒子表面的氨基基团，所述氨基质量百分含量为3.5‑4.5%。本发明专利技术利用共沉淀法制备出的磁性Fe3O4纳米粒子粒径在15‑20 nm，超顺磁性良好，粒径大小均匀。经改性后，Fe3O4@SiO2‑NH2粒径均一良好，氨基含量多，保持了磁性Fe3O4纳米粒子的结构，且具有良好的磁学性能，利用磁力可以进行分离回收。本发明专利技术利用Fe3O4@SiO2‑NH2微球固定化载体固定化乙酰胆碱酯酶有比较高的回收率，稳定性优良、可以重复利用且容易储存。

Acetylcholinesterase immobilization carrier and preparation method and application thereof

The present invention discloses an acetylcholinesterase immobilization carrier, which is characterized in that the structure of the immobilized carrier is expressed as Fe3O4@SiO2 NH2, which includes magnetic Fe3O4 nanoparticles of the spherical spinel structure, the size of the particle size is 15, and the silicon dioxide coated on the surface of the magnetic Fe3O4 nanoscale particles, and the modified silicon dioxide coated on the surface of the magnetic Fe3O4 nanoscale particles. On the surface of Fe3O4@SiO2 nanoparticles, the mass fraction of amino group is 3.5 4.5%. The magnetic Fe3O4 nanoparticles prepared by coprecipitation method have a particle diameter of 15 to 20 nm, with super paramagnetic property and uniform particle size. After modification, the particle size of Fe3O4@SiO2 NH2 is good, the content of the amino group is more, the structure of magnetic Fe3O4 nanoparticles is maintained, and the magnetic properties are good, and the magnetic force can be used for separation and recovery. The invention uses the immobilized carrier of Fe3O4@SiO2 NH2 microspheres to immobilize acetylcholinesterase with high recovery rate, excellent stability, can be reused and easy to store.

【技术实现步骤摘要】
一种乙酰胆碱酯酶固定化载体及其制备方法和应用
本专利技术涉及一种用于酶固定化载体的磁性纳米材料，具体涉及一种用于乙酰胆碱酯酶固定化的磁性Fe3O4纳米粒子载体及其制备方法和固定化酶的应用，属于新型材料制备

技术介绍
乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）是一种能特异性降解（通过其水解催化活性）神经递质乙酰胆碱成为胆碱和己酸的酶，它具有羧肽酶和氨肽酶的活性，能终止神经递质对突触后膜的刺激作用，从而保证神经信号在生物体内的正常传递。乙酰胆碱酯酶存在于脊椎动物胆碱能神经节、线虫及无脊椎动物神经肌肉接头处，它同时也是昆虫神经传导过程中一种重要的酶类，是很多神经毒剂的作用靶标，乙酰胆碱酯酶受抑制时可使生物体产生致死效应，因此它是一种重要的靶标酶。酶作为一种催化活性蛋白，稳定性较差，脱离细胞环境后，在温度、pH及无机离子等外界因子的作用下，活性便会严重受损甚至失活。此外由于酶的水溶性较强，在水溶液中反应时会导致酶、底物及产物的分离困难，即使催化过程结束后部分酶蛋白分子仍具有较髙的活性，也很难再被分离回收。酶固定化技术（immobilizationofenzymes）的出现彻底解决了这些问题。酶固定化是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，使其仍能进行特有的催化反应，并可回收和重复利用的一类技术，是现代酶工程领域的研究热点之一。固定化酶与游离酶相比具有储存稳定性高、方便回收、重复使用和操作连续可控等优点。目前，酶固定化技术己在纺织工程、生物工程、食品工业、精细化工、医药、生命科学与环境科学等领域得到了广泛的应用。近年来关于固定化乙酰胆碱酯酶的研究报道较多，主要是将乙酰胆碱酯酶固定化，进行生物传感器的研制，固定方法也相对简单（陈军辉,史倩,陈晨,等.固定化乙酰胆碱酯酶的制备及其特性研究[J].化学学报,2012,70(5):624-628；MarinovI,GabrovskaK,VelichkovaJ,etal.Immobilizationofacetylcholinesteraseonnanostructurepolyacrylonitrilemembranes.[J].InternationalJournalofBiologicalMacromolecules,2009,44(4):338-45；JeyapragasamT,SaraswathiR.Electrochemicalbiosensingofcarbofuranbasedonacetylcholinesteraseimmobilizedontoironoxide–chitosannanocomposite[J].Sensors&ActuatorsBChemical,2014,191(6-7):681-687.）。磁性纳米粒子特殊的磁性，对于酶的再回收利用具有其他材料没有的优越性，但目前将磁性纳米粒子用于固定乙酰胆碱酯酶的研究鲜见报道，且已有研究固定化酶的方法相对简单，使用的磁性纳米粒子四氧化三铁多是成品，而四氧化三铁极其容易因氧化而变性。而且由于四氧化三铁磁性纳米粒子比较活跃，不好进行利用，所以需要通过表面修饰来降低粒子的表面能，从而提高其稳定性和可靠性。如何保证乙酰胆碱酯酶固定化后的高效性、高活性以及高稳定性，是固定化乙酰胆碱酯酶的关键和瓶颈。鉴于目前固定化酶的方法尚存在各种不足，乙酰胆碱酯酶已有的固定化方法还不能满足实际应用的需求。因此，不断提出和改进现有固定化乙酰胆碱酯酶性能的技术迫在眉睫。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种具有良好的磁学性能，利用磁力可以进行分离回收的用于乙酰胆碱酯酶固定化载体的磁性Fe3O4纳米粒子，在保证保持其良好的磁性和纳米粒径的前提下，通过表面改性降低其表面能，得到稳定可靠的磁性纳米粒子，用于固定化乙酰胆碱酯酶从而具有高的回收率，稳定性优良、可以重复利用且容易储存。本专利技术的另一个目的是提供上述乙酰胆碱酯酶固定化载体的制备方法。本专利技术的第三个目的是提供上述方法制备的磁性Fe3O4纳米粒子在固定化乙酰胆碱酯酶上的应用。为达到上述目的，本专利技术采取的具体技术方案为：一种乙酰胆碱酯酶固定化载体，其特征在于，所述固定化载体的结构表示为Fe3O4@SiO2-NH2，其包括球状尖晶石结构的磁性Fe3O4纳米粒子，粒径大小为15-20nm，包覆于所述磁性Fe3O4纳米粒子表面的二氧化硅，以及修饰于Fe3O4@SiO2纳米粒子表面的氨基基团，所述氨基质量百分含量为3.5-4.5%。上述乙酰胆碱酯酶固定化载体的制备方法，包括以下步骤：（1）制备磁性Fe3O4纳米粒子：利用共沉淀法制备，将铁盐和亚铁盐混合，在碱性溶液条件下，得到均一的黑色粉末状的磁性Fe3O4纳米粒子（MNP）；（2）磁性Fe3O4纳米粒子的硅烷化：将上述制得的磁性Fe3O4磁性纳米粒子混合，加入无水乙醇和蒸馏水，同时在氮气保护下，搅拌至体系均匀，然后超声、搅拌并滴加氨水，直到pH值调节至9，在超声下加入正硅酸乙酯（TEOS），反应得到棕色的溶液，进行磁性分离，清洗，旋转蒸发、真空干燥得到棕色的粉末状硅烷化的Fe3O4磁性纳米粒子Fe3O4@SiO2（SMNP）；（3）氨基包覆：将步骤（2）制得的SMNP加入至甲苯中，超声至体系均匀，然后在超声下缓慢加入氨水，整个过程中都要氮气保护下进行，剧烈搅拌下加入3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）超声下反应，进行磁性分离，清洗后真空干燥，即得到黑色颗粒状的磁性Fe3O4@SiO2-NH2纳米微球固定化载体。所述磁性Fe3O4纳米微球固定化载体用于固定化乙酰胆碱酯酶的应用。上述乙酰胆碱酯酶固定化载体用于固定化乙酰胆碱酯酶的方法为：将磁性Fe3O4@SiO2-NH2纳米微球载体加入乙酰胆碱酯酶蛋白液中，开始震荡摇动，用磁力将产物分离出来，即可得到固定化乙酰胆碱酯酶。进一步的，上述固定化酶的方法中，固定化酶的最优条件为：固定化温度为35℃，酶蛋白浓度为1.5U/mL，固定化体系pH为8.0，固定化时间为12h；酶活的最优条件是：固定化温度为30℃，酶蛋白浓度为1.0U/mL，固定化体系pH为8.0，固定化时间为12h。本专利技术的优点和技术效果：本专利技术利用共沉淀法制备出的磁性Fe3O4纳米粒子粒径在15-20nm，超顺磁性良好，粒径大小均匀。经改性后，Fe3O4@SiO2-NH2粒径均一良好，氨基含量多，保持了磁性Fe3O4纳米粒子的结构，且具有良好的磁学性能，利用磁力可以进行分离回收。本专利技术利用Fe3O4@SiO2-NH2微球固定化载体固定化乙酰胆碱酯酶有比较高的回收率，稳定性优良、可以重复利用且容易储存。附图说明图1为不同磁性纳米粒子的TEM图。图2为不同磁性纳米粒子XRD谱图。图3为不同磁性纳米粒子的红外光谱图。图4为不同磁性纳米粒子的磁滞回线图。图5为不同磁性纳米粒子的热重分析图。图6为不同蛋白浓度对固定化酶吸附率的影响结果图。图7为不同蛋白酶浓度对固定化酶活力的影响结果图。图8为固定化温度对固定化酶活力吸附率的影响结果图。图9为固定化温度对固定化酶活力的影响结果图。图10为体系pH对固定化酶活力吸附率的影响结果图。图11为体系pH对固定化酶活力的影响结果图。图12为固定化时间对固定化本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种乙酰胆碱酯酶固定化载体，其特征在于，所述固定化载体的结构表示为Fe3O4@SiO2‑NH2，其包括球状尖晶石结构的磁性Fe3O4纳米粒子，粒径大小为15‑20 nm，包覆于所述磁性Fe3O4纳米粒子表面的二氧化硅，以及修饰于Fe3O4@SiO2纳米粒子表面的氨基基团，所述氨基质量百分含量为3.5‑4.5%。

【技术特征摘要】
1.一种乙酰胆碱酯酶固定化载体，其特征在于，所述固定化载体的结构表示为Fe3O4@SiO2-NH2，其包括球状尖晶石结构的磁性Fe3O4纳米粒子，粒径大小为15-20nm，包覆于所述磁性Fe3O4纳米粒子表面的二氧化硅，以及修饰于Fe3O4@SiO2纳米粒子表面的氨基基团，所述氨基质量百分含量为3.5-4.5%。2.一种权利要求1所述的乙酰胆碱酯酶固定化载体的制备方法，包括以下步骤：（1）制备磁性Fe3O4纳米粒子：利用共沉淀法制备，将铁盐和亚铁盐混合，在碱性溶液条件下，得到均一的黑色粉末状的磁性Fe3O4纳米粒子；（2）磁性Fe3O4纳米粒子的硅烷化：将上述制得的磁性Fe3O4磁性纳米粒子混合，加入无水乙醇和蒸馏水，同时在氮气保护下，搅拌至体系均匀，然后超声、搅拌并滴加氨水，直到pH值调节至9，在超声下加入正硅酸乙酯，反应得到棕色的溶液，进行磁性分离，清洗，旋转蒸发、真空干燥得到棕色的粉末状硅烷化的...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐香，蓝靖，许凌宇，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37