一种人乙酰胆碱酯酶异构体蛋白（AR－ACHE）及基因编码序列制造技术

本发明专利技术提供了一种人各种组织细胞发生凋亡时表达的新的人乙酰胆碱酯酶异构体蛋白（ＡＲ－ＡＣＨＥ）及基因编码序列。它的ｃＤＮＡ长度为１９３６ｂｐ，蛋白质由５２６个氨基酸残基组成。本发明专利技术还提供了该蛋白和核酸序列的制备方法、在样品中检测人乙酰胆碱酯酶异构体蛋白（ＡＲ－ＡＣｈＥ）核酸序列和多肽的方法以及用该蛋白质或基因促使细胞凋亡，或者用该基因反义核酸或抗体阻止细胞凋亡的方法。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及酶学和分子细胞生物学，尤其是关于参与细胞凋亡过程中的酶。具体地，本专利技术涉及一种人类各组织细胞在发生细胞凋亡时表达的乙酰胆碱酯酶异构体蛋白(AR-ACHE)及其核酸序列。乙酰胆碱酯酶(EC 3.1.17，acetylcholinesterase，ACHE)是神经递质乙酰胆碱的水解酶，属于糖蛋白。主要存在于电鳐的电器官、哺乳动物的胆碱能神经、神经-肌接头、红细胞膜(Zakut-H；et alJ-Clin-Invest.1990，86(3)900-8)以及啮齿动物的巨核细胞血小板中(A.Shafferman and B.Velan，Multidisplinary approaches to cholinesterase functions.1992 Plenum Press，New York)。人的乙酰胆碱酯酶基因位于7号染色体上(7q22)，目前发现有3种不同的剪切形式神经肌肉型、红细胞型和通读型(Soreq，H.et al.Proc Natl AcadSci U S A.1990，87，9688-92；Soreq，H.et al.Proc Natl Acad Sci U S A.1994，91，7907-11)。乙酰胆碱酯酶在胆碱能神经系统的功能是水解神经递质乙酰胆碱，使之生成胆碱和乙酸。红细胞型和通读型的功能不清楚，也有报道认为乙酰胆碱酯酶具有丝氨酸蛋白酶的水解蛋白活性.。近年来，由于体外培养的肿瘤细胞株也检测到AChE mRNA的转录和化疗后的卵巢癌患者的血清检测到乙酰胆碱酯酶活性，有作者认为乙酰胆碱酯酶与肿瘤发生有关(Lev-Lehman-E，et alBlood.1997，89(10)3644-53)。老年性痴呆(AD)是退行神经性中较多见的疾病。虽然AD病人脑中的总ACHE活性是降低的，但在老年斑中和老年斑周围的ACHE活性却是升高的(Javier Saez-Valero et al.，J.Neurochem.1999，Vol.72，1600-1608；Opazo-G & Inestrosa-NC，Mol-Chem-Neuropathol.1998，33(1)39-49；MimoriY.et al.，Behav Brain Res.1997，83(1-2)25-30.)，而且，与神经递质降解功能无关。已经证明发现老年性痴呆患者病灶处有凋亡细胞存在，在长期研究细胞凋亡过程中，发现哺乳动物包括人类的一切细胞株，除了红细胞外，经过诱导，启动凋亡过程中表达乙酰胆碱酯酶异构体，这个结果可以很好注释上述现象。我们已经申请了该类酶的获得方法(张学军等，中国专利申请号97 1 25216.5，专利技术专利证书第61260号)和部分功能(张学军等，中国专利申请号97 1 25220.3，公开号CN 1186859)的专利。本专利技术采用RACE等方法，获得了AR-ACHE的cDNA全序列。本专利技术的第一目的就是提供一种新的人基因乙酰胆碱酯酶异构体(AR-ACHE)(Genbank Accession No.AF334270未公开)，该基因是一个人乙酰胆碱酯酶异构体(AR-ACHE)蛋白基因。本专利技术的第二目的是提供一种利用重组技术生产上述的新的人乙酰胆碱酯酶异构体(AR-ACHE)蛋白和核酸序列的方法。本专利技术还提供了这种人乙酰胆碱酯酶异构体(AR-ACHE)蛋白多肽和编码序列的应用。本专利技术使用了体外培养的SK-N-SH，人肺成纤维细胞(HLF)、K562等细胞株，用DMEM，1640培养基，添加10％小牛血清，在37℃，5％CO2，培养箱培养。诱导细胞凋亡方法有3种自然衰老法，UV-B和化疗药物诱导法。自然衰老法，培养细胞，3-4天不换培养液，这时，贴壁生长的细胞，部分失去贴壁能力，进入了凋亡过程，收集这时的细胞。药物诱导法用抗肿瘤药物或低血清或去细胞因子等方法诱导细胞凋亡。对于细胞因子依赖的细胞株，入M07e巨核细胞株，只要在培养液中不加入GM-CSF，2-3天后，大量细胞发生凋亡，收集这时的细胞。UV-B诱导10分钟，培养18小时后可收集凋亡细胞。全过程的具体操作如下总RNA提取将SK-N-SH细胞，HLF或K562在1640培养基中(Gibco BRL公司)于不换液的条件下培养至细胞凋外亡状态，然后用Trizol试剂(Gibco BRL公司)提取细胞总RNA。约106细胞加入1ml Trizol，吹打均匀后室温放置5分钟，加入0.2ml氯仿，剧烈摇动15秒，室温放置3分钟。然后4℃ 12000g离心15分钟，吸出上层无色水相，加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟，4℃ 12000g离心10分钟。再用75％乙醇洗沉淀，7500g，4℃离心5分钟。待干燥后溶于DEPC处理过的水中，-70℃保存备用。mRNA的分离先将总RNA定量，再使用Qiagen公司的Oligotex mini mRNA Kit按Kit的产品操作手册分离mRNA，溶于DEPC处理过的水中，-70℃保存备用。基因的全长克隆(1)RT-PCR根据人类ACHE基因的序列，设计5′和3′引物，引物序列为R1(SEQ IDNo.3)5′-cttccacggcctgcagctggct-3′，(正向)，R2(SEQ ID No.4)5′-gacaagcttacaggtctgagcagcgatcctgcttgct-3′(反向)，采用常规方法合成上述引物。用SK-N-SH细胞的mRNA进行RT-PCR扩增。条件为96℃ 3分钟后，以95℃ 30秒，72℃ 2分钟做5个循环，再以95℃ 30秒，70℃ 30秒，72℃ 1分钟做39个循环，最后72℃延伸10分钟，电泳检测PCR产物为527bp长度，将产物克隆测序，发现存在一种与人类正常ACHE基因不同的拼接形式。(2)cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA ends，RACE)根据已经测得的序列，设计5′和3′引物，用SK-N-SH细胞mRNA的RT产物分别扩增上游和下游序列，将PCR产物克隆测序。通过使用以上两种方法，获得了人类AR-ACHE的全长(见SEQ IDNo.1)。人AR-ACHE基因的序列信息与同源性分析本专利技术新的人AR-ACHE全长cDNA(GenBank AccessionNo.AF334270)的长度为1936bp；其中开放读框位于106-1686位核苷酸(见SEQ ID No.1)。根据全长cDNA推导出人AR-ACHE的氨基酸序列，共526个氨基酸残基(见SEQ ID No.2)，分子量58352.30D，PI为6.44.将AR-ACHE的全长cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与人的ACHE基因至少存在85.7％的同源性。但AR-ACHE是一种人ACHE基因的异常拼接形式基因。在核苷酸水平上，它是人ACHE基因的mRNA全编码序列(GenBank Accessio本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离出的人乙酰胆碱酯酶的ＤＮＡ分子，其特征在于，它包括有ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１所示的ｃＤＮＡ序列的人乙酰胆碱酯酶异构体。

【技术特征摘要】
1.一种分离出的人乙酰胆碱酯酶的DNA分子，其特征在于，它包括有SEQ ID No.1所示的cDNA序列的人乙酰胆碱酯酶异构体。2.根据权利要求1所述的人乙酰胆碱酯酶的DNA分子，其特征在于，所述人乙酰胆碱酯酶异构体的cDNA与人的乙酰胆碱酯酶所示cDNA序列至少85.7％的同源性，且为人ACHE基因Exon3中从第一到第264碱基缺失所形成的新的乙酰胆碱酯酶DNA分子。3.根据权利要求1所述的人乙酰胆碱酯酶的DNA分子，其特征在于它包含有SEQ ID No.2所示的多肽氨基酸序列的人乙酰胆碱酯酶异构体蛋白多肽。4.一种产生具有人乙酰胆碱酯酶异构体(AR-ACHE)蛋白质的方法，特征在于它的步骤如下；(1)将编码具有人乙酰胆碱酯酶异构体(AR-ACHE)蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人乙酰胆碱酯酶异构体(AR-ACHE)蛋白表达载体；(2)将步骤(1)中的表达载体转入宿主细胞，形成乙酰胆碱酯酶异构体(AR-ACHE)蛋白的重组细胞；(3)在适合表达人乙酰胆碱酯酶异构体(AR-ACHE)蛋白多肽的条件下，培养步骤(2)中的重组细胞；(4)分离出具有人乙酰胆碱酯酶异构体(AR-ACHE)蛋白活性的多...

【专利技术属性】
技术研发人员：张学军，杨磊，贺恒益，
申请(专利权)人：中国科学院上海细胞生物学研究所，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]