一种重组GP96-ScFv蛋白及其制备方法和应用技术

本申请提供了用于纯化GP96蛋白和/或GP96蛋白‑多肽复合体的亲和树脂和亲和层析柱，其包含共价连接的生物素化的GP96‑ScFv蛋白和链霉亲和素树脂。本申请还提供了包含上述亲和树脂或亲和层析柱的GP96蛋白和/或GP96蛋白‑多肽复合体纯化试剂盒。此外本申请还提供了制备用于纯化GP96蛋白和/或GP96蛋白‑多肽复合体的亲和树脂的方法，通过所述亲和树脂纯化GP96蛋白和/或GP96蛋白‑多肽复合体的方法以及获得的GP96蛋白和/或GP96蛋白‑多肽复合体的用途。

Recombinant GP96-ScFv protein and preparation method and application thereof

This application provides an affinity resin and affinity chromatography column for purification of GP96 protein and / or GP96 protein polypeptide complex, which contains a covalent binding of the biotinylated GP96 ScFv protein and streptavidin resin. The application also provides GP96 protein and / or GP96 peptide polypeptide purification kit containing the affinity resin or affinity chromatography column. In addition, this application also provides a method for preparing an affinity resin for purifying GP96 protein and / or GP96 protein polypeptide complex, purifying the GP96 protein and / or GP96 protein polypeptide complex through the affinity resin, and the use of the obtained GP96 protein and / or GP96 protein polypeptide complex.

【技术实现步骤摘要】
一种重组GP96-ScFv蛋白及其制备方法和应用专利
本申请大体涉及生物
，具体而言，本申请涉及用于纯化GP96蛋白/GP96蛋白-多肽复合体的工具和方法，以及所获得的纯化的GP96蛋白/GP96蛋白-多肽复合体的用途。专利技术背景GP96蛋白属于热休克蛋白90家族，是内质网中最丰富的蛋白质之一，在细胞内发挥着分子伴侣的作用。在天然免疫中，GP96通过与Toll样受体等相互作用刺激抗原递呈细胞产生各种细胞因子激活免疫系统。而在获得性免疫中，GP96-抗原肽复合体通过抗原交叉将抗原肽呈递给MHC-I类分子，诱发机体抗原特异性细胞毒性T细胞免疫应答，清除病原物感染和肿瘤。近年来的研究还发现GP96具有免疫佐剂的功能。因而，GP96蛋白是一类十分重要的蛋白分子，在机体的免疫中发挥重要作用。获得纯度较高的GP96蛋白和GP96蛋白-多肽复合体有助于更好地研究和利用该蛋白及其形成的复合体。因此GP96蛋白的纯化，特别是GP96蛋白-多肽复合体的纯化具有重要意义。当前用于蛋白纯化的主要技术有透析、超滤、沉淀、盐析、离子交换、亲和层析、电泳和吸附分离等。然而这些纯化技术都不能特异性纯化GP96蛋白，利用这些纯化方法纯化后的蛋白存在一定量的杂蛋白。如果用仅与GP96蛋白特异性结合的物质作为用于GP96蛋白亲和纯化的载体，则可大大提高纯化的GP96蛋白和/或GP96蛋白-多肽复合体的纯度。可以利用此类纯化手段纯化GP96蛋白和/或GP96蛋白-多肽复合体，以更好地研究和应用GP96蛋白和/或GP96蛋白-多肽复合体。专利技术概述第一方面，本专利技术提供了纯化GP96蛋白和/或GP96蛋白-多肽复合体的亲和树脂，其包含共价连接的生物素化的GP96-ScFv蛋白和链霉亲和素树脂。第二方面，本专利技术提供了纯化GP96蛋白和/或GP96蛋白-多肽复合体的亲和层析柱，其装填共价连接有生物素化的GP96-ScFv蛋白的链霉亲和素树脂。第三方面，本专利技术提供了GP96蛋白和/或GP96蛋白-多肽复合体纯化试剂盒，其包含第一方面的亲和树脂或第二方面的亲和层析柱。在一些实施方案中，GP96蛋白和/或GP96蛋白-多肽复合体纯化试剂盒还包含用于蛋白纯化的平衡液、洗脱液和透析液中的至少一种。第四方面，本专利技术提供了制备用于纯化GP96蛋白和/或GP96蛋白-多肽复合体的亲和树脂的方法，其包括下述步骤：(1)重组表达含有纯化标签、GP96-ScFv和生物素化标签的融合蛋白；(2)利用所述纯化标签纯化所述融合蛋白；(3)将步骤(2)中得到的融合蛋白生物素化；以及(4)将步骤(3)中得到的生物素化的融合蛋白与链霉亲和素树脂连接。在一些实施方案中，步骤(2)包括在纯化后从所述融合蛋白切除所述纯化标签。第五方面，本专利技术提供了纯化GP96蛋白和/或GP96蛋白-多肽复合体的方法，包括将包含GP96蛋白和/或GP96蛋白-多肽复合体的样品与第一方面所述的亲和树脂接触。在一些实施方案中，样品来源于哺乳动物组织或细胞。在一些实施方案中，样品来源于个体的肿瘤组织、非肿瘤病理组织、血液样本中的细胞，或体外培养的被病原体感染的哺乳动物细胞或人细胞。第六方面，本专利技术提供了利用第五方面所述的方法获得的GP96蛋白和/或GP96蛋白-多肽复合体。第七方面，提供了利用第五方面所述的方法获得的GP96蛋白和/或GP96蛋白-多肽复合体在自身细胞变异、因外源性病原体感染以及自身免疫疾病的治疗和预防中的用途。附图简要说明图1A为切除GST标签并且生物素化的GP96-ScFv蛋白与GP96抗原结合的Western印迹结果，泳道1为标准蛋白质；泳道2为Western印迹结果。图1B为阳性对照、阴性对照与GP96抗原结合的Western印迹结果，泳道1为标准蛋白质；泳道2为阳性对照Western印迹结果，其中阳性对照为商购的GP96一抗；泳道3为阴性对照Western印迹结果，其中阴性对照为鼠源GST一抗。图2为生物素化的GP96-ScFv蛋白与链霉亲和素树脂结合后的GP96蛋白亲和树脂及上清的SDS-PAGE蛋白凝胶电泳图。其中泳道1为标准蛋白质；泳道2为链霉亲合树脂与生物素化的GP96-ScFv的结合；泳道3为游离的生物素化的GP96-ScFv蛋白。其中约31KD处的蛋白为目的蛋白，其余条带为链霉亲合素树脂。图3为显示用制备的GP96蛋白亲和树脂纯化GP96蛋白的结果的SDS-PAGE蛋白凝胶电泳图。其中泳道1为收集的GP96；泳道2为标准蛋白质。专利技术详述本申请的专利技术人通过探索和研究，开发出了用于纯化GP96蛋白和/或GP96蛋白-多肽复合体的新的工具和方法，为GP96蛋白纯化提供了新的技术路线。在第一方面，本专利技术提供了纯化GP96蛋白和/或GP96蛋白-多肽复合体的亲和树脂，其包含共价连接的生物素化的GP96-ScFv蛋白和链霉亲和素树脂。本领域中所周知，GP96蛋白属于热休克蛋白90家族，在细胞内发挥着分子伴侣的作用。其能够通过与Toll样受体等相互作用刺激抗原递呈细胞产生各种细胞因子激活免疫系统。此外，GP96能够与不同的抗原肽结合而形成本申请所述的“GP96蛋白-多肽复合体”，该复合体能够诱发机体抗原特异性细胞毒性T细胞免疫应答，清除病原物感染和肿瘤。单链可变区片段(ScFv,single-chainfragmentvariable)是由大约10-25个氨基酸短肽相连的免疫球蛋白的重链可变区和轻链可变区的融合蛋白。尽管移除了恒定区，其仍保留了原免疫球蛋白的特异性。因此，本申请提供的GP96蛋白的ScFv能够特异性结合GP96蛋白，从而达到特异性纯化GP96蛋白和/或GP96蛋白-多肽复合体的目的。生物素-亲和素系统是70年代末发展起来的一种新型的生物反应放大系统，被广泛应用于医学各领域。但是由于亲和素带有一个糖链侧链，导致容易与细胞表面的多糖发生非特异性亲和。链霉亲和素是由阿维丁链霉菌(streptomycesavidinii)分泌的一种蛋白质，其由4条相同的肽链组成，每条肽链都能结合一个生物素，并且不带任何糖基，因而链霉亲和素的非特异性结合远低于亲和素。不为任何理论所束缚，本申请中的生物素-链霉亲和素系统与亲和层析方法的联合使用大大提高了纯化的蛋白质的纯度。第二方面，本专利技术提供了纯化GP96蛋白和/或GP96蛋白-多肽复合体的亲和层析柱，其装填共价连接有生物素化的GP96-ScFv蛋白的链霉亲和素树脂。第三方面，本专利技术提供了GP96蛋白和/或GP96蛋白-多肽复合体纯化试剂盒，其包含第一方面的亲和树脂或第二方面的亲和层析柱。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含用于蛋白纯化的平衡液、洗脱液和透析液中的至少一种。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含用于配制平衡液、洗脱液和透析液中的至少一种的固体成分。第四方面，本专利技术提供了制备用于纯化GP96蛋白和/或GP96蛋白-多肽复合体的亲和树脂的方法，其包括下述步骤：(1)重组表达含有纯化标签、GP96-ScFv和生物素化标签的融合蛋白；(2)利用所述纯化标签纯化所述融合蛋白；(3)将步骤(2)中得到的融合蛋白生物素化；以及(4)将步骤(3)中得到的生物素化的融合蛋白与链霉亲和素树脂连接。融合蛋白的构建和重组表达是本领域中已知的技本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于纯化GP96蛋白和/或GP96蛋白‑多肽复合体的亲和树脂，其包含共价连接的生物素化的GP96‑ScFv蛋白和链霉亲和素树脂。

【技术特征摘要】
1.用于纯化GP96蛋白和/或GP96蛋白-多肽复合体的亲和树脂，其包含共价连接的生物素化的GP96-ScFv蛋白和链霉亲和素树脂。2.用于纯化GP96蛋白和/或GP96蛋白-多肽复合体的亲和层析柱，其装填共价连接有生物素化的GP96-ScFv蛋白的链霉亲和素树脂。3.GP96蛋白和/或GP96蛋白-多肽复合体纯化试剂盒，其包含权利要求1所述的亲和树脂或权利要求2所述的亲和层析柱。4.如权利要求3所述的试剂盒，其还包含用于蛋白纯化的平衡液、洗脱液和透析液中的至少一种。5.制备用于纯化GP96蛋白和/或GP96蛋白-多肽复合体的亲和树脂的方法，其包括下述步骤：(1)重组表达含有纯化标签、GP96-ScFv和生物素化标签的融合蛋白；(2)利用所述纯化标签纯化所述融合蛋白，任选地，在纯化后从所述融合蛋白切除...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈音，樊敏杰，韩化敏，刘书磊，刘丽平，
申请(专利权)人：拜西欧斯北京生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11