双基因表达载体及其制备方法和应用技术

本申请提供了双基因表达载体及其制备方法和应用。本申请的双基因表达载体包含第一筛选单元、第一目的蛋白表达单元、第二筛选单元和第二目的蛋白表达单元。本申请还涉及包含该双基因表达载体的动物细胞，以及使用该动物细胞产生多聚体蛋白质例如抗体的方法。

Bigene expression vector and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
双基因表达载体及其制备方法和应用
本申请涉及生物
，具体涉及一种用于动物细胞的双基因表达载体、该表达载体的构建方法、用该表达载体转染的动物细胞、该表达载体在制备药物中的应用和用该表达载体转染的动物细胞生产抗体的方法。
技术介绍
在治疗癌症等适应症的靶向药物中，越来越多的药物是通过基因重组技术生产的生物制品。在通过基因工程生产生物制品的工艺中，外源基因在宿主细胞中高效表达目的蛋白或多肽是研究开发蛋白质或多肽类药物的先决条件。用于表达重组蛋白的表达体系有微生物细胞例如细菌和酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞和动物细胞等。具有正常生物学活性的蛋白往往只能在动物细胞中合成。与大肠杆菌、酵母及昆虫细胞相比，动物细胞表达的外源基因产物与天然蛋白在结构、糖基化类型和糖基化方式上几乎相同，并可大规模、高密度培养来生产正确组装的目的蛋白，特别是多亚基蛋白。另外，癌症的分子病理学研究表明，癌症的发展涉及多靶标的分子生物学通路。因此，针对一种癌症的致病机制通路上的多个靶点的药物成为癌症治疗领域的重要发展趋势。很多多聚物性质的药物由多个不同亚单位构成。然而，在基因工程领域中，通常使用的采用单一目的蛋白表达载体分别表达两种治疗性组分或一个多亚基大分子的两个以上亚基的原核表达系统已经无法满足当前癌症治疗领域的药物生产需求。所以，本领域仍需要能够同时获得多个基因编码的产物的方法。多基因表达载体的设计成为许多药物基因工程领域的难题。如何利用快速构建双基因甚至多基因表达载体用于生产联合治疗组分或多聚物的多个不同亚基成为一个亟待研究和解决的问题。因此，构建一种适用于将蛋白生物制品在动物细胞中高效表达的载体在药物工业生产中意义重大。本领域亟待开发适合多组分或多亚基蛋白生物制品高效表达的真核表达载体，并利用该载体大规模生产该蛋白质生物治疗剂。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本申请提供了一种基于PCR的构建过程简单的双基因表达载体。该双基因表达载体可基于高的代谢途径选择压力安全高效地表达多基因编码的目的蛋白，满足癌症治疗领域和科研领域生产多基因编码的产品的需求。本申请已证实该双基因表达载体能高产率地表达两种筛选基因和目的蛋白，为基因工程药物特别是抗体药物的生产利用提供一条快速途径。根据本申请的一些实施方案提供包含两个表达单元的双基因表达载体。该表达载体当被转染到动物细胞中后能够稳定而高效地产生目的蛋白，例如抗体。特别地，本申请的第一方面提供了一种双基因表达载体，包含顺次连接的分别处于不同的启动子控制之下的第一筛选单元、第一目的蛋白表达单元、第二筛选单元和第二目的蛋白表达单元，其中，所述第一筛选单元的启动子的功能被弱化以使第一目的蛋白和第二目的蛋白的表达量升高，并且第二目的蛋白的表达量高于第一目的蛋白。在一些实施方案中，所述第一筛选单元可以包含启动子A、第一筛选基因和多聚腺苷酸(polyA)加尾信号1；所述第一目的蛋白表达单元可以包含启动子B、内含子、多克隆位点(MCS)1和polyA加尾信号2；所述第二筛选单元可以包含polyA加尾信号2、第二筛选基因、启动子C；并且所述第二目的蛋白表达单元可以包含启动子D、多克隆位点(MCS)2和polyA加尾信号3；所述第二筛选单元相对于所述第一筛选单元、所述第一目的蛋白表达单元和所述第二目的蛋白表达单元反向插入，并且所述第一目的蛋白表达单元和所述第二筛选单元共用所述polyA加尾信号2。在一些实施方案中，所述启动子A、所述启动子B、所述启动子C和所述启动子D可以各自独立地选自或衍生自由以下组成的组：猿病毒40(SV40)早期启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子和人延长因子1-α(hEF1-α)启动子；所述polyA加尾信号1、所述polyA加尾信号2和所述polyA加尾信号3可以各自独立地选自或衍生自由SV40polyA、CMVpolyA和BGHpolyA组成的组；所述内含子可以选自或衍生自由SV40内含子、兔β-球蛋白基因内含子或人巨细胞病毒(HCMV)主要立即早期基因第一内含子组成的组。在一些实施方案中，所述第一筛选基因可以是编码宿主细胞缺陷酶的基因，所述第二筛选基因可以为抗生素抗性基因，并且所述编码宿主细胞缺陷酶的基因可以包括但不限于二氢叶酸还原酶(DHFR)基因或谷氨酰胺合成酶(GS)基因；所述第二筛选基因可以包括但不限于新霉素(neo)抗性基因、嘌呤霉素抗性基因或潮霉素抗性基因。在一些实施方案中，所述第一筛选基因可以是二氢叶酸还原酶(DHFR)基因；并且所述第二筛选基因可以是新霉素(neo)抗性基因。在一些实施方案中，所述启动子A可以是SV40早期启动子或衍生自SV40早期启动子，所述polyA加尾信号1可以是SV40早期polyA或衍生自SV40早期polyA；所述启动子B可以是CMV启动子或衍生自CMV启动子，所述内含子可以是CMV内含子或衍生自CMV内含子；所述启动子C可以是SV40启动子或衍生自SV40启动子，所述polyA加尾信号2可以是SV40晚期polyA或衍生自SV40晚期polyA；并且所述启动子D可以是hEF1-α启动子或衍生自hEF1-α启动子，所述polyA加尾信号3可以是BGHpolyA或衍生自BGHpolyA。在一些实施方案中，所述启动子A可以是由SEQIDNO:9所示的核苷酸序列构成的弱化的SV40衍生启动子；所述启动子B可以是由SEQIDNO:11所示的核苷酸序列构成的CMV启动子；所述启动子C可以是由SEQIDNO:10所示的核苷酸序列构成的SV40启动子；所述启动子D可以是由SEQIDNO:12所示的核苷酸序列构成的人延长因子1-α(hEF1-α)启动子的衍生启动子；所述polyA加尾信号1可以为SEQIDNO:13所示的SV40早期polyA，所述polyA加尾信号2可以为SEQIDNO:14所示的SV40晚期polyA；并且所述polyA加尾信号3可以为SEQIDNO:15所示的BGHpolyA。本申请在第二方面提供了一种构建本申请的双基因表达载体的方法，包括扩增程序和拼接程序，其中所述扩增程序包括步骤：(a)PCR扩增包含所述polyA加尾信号3和原核复制起始点(ori)的5’-3’方向顺次连接物的片段11和包含抗生素抗性基因的片段12；(b)PCR扩增包含所述启动子A、所述第一筛选基因和所述polyA加尾信号2的5’-3’方向顺次连接物的片段13，所述片段13包含所述第一筛选单元；(c)PCR扩增片段14和片段15，其中所述片段14包含所述启动子B，所述片段15为包含所述内含子、所述MCS1和所述polyA加尾信号2的5’-3’顺次连接物；(d)PCR扩增包含所述polyA加尾信号2的片段21，以及含有所述第二筛选基因和所述启动子C的5’-3’顺次连接物的片段22；(e)PCR扩增包含所述启动子D和所述MCS2的5’-3’方向顺次连接物的片段24；所述拼接程序包括：(a’)按5’-3’方向顺次拼接所述片段11和所述片段12为片段16；(b’)按5’-3’方向顺次拼接所述片段14和所述片段15为片段17，所述片段17包含所述第一表达单元；(c’)按5’-3’方向顺次拼接所述片段13和所述片段17为片段18；(d’)按5’-3’方向顺次拼接所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种双基因表达载体，包含顺次连接的分别处于不同的启动子控制之下的第一筛选单元、第一目的蛋白表达单元、第二筛选单元和第二目的蛋白表达单元，其中，所述第一筛选单元的启动子的功能被弱化以使第一目的蛋白和第二目的蛋白的表达量升高，并且第二目的蛋白的表达量高于所述第一目的蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种双基因表达载体，包含顺次连接的分别处于不同的启动子控制之下的第一筛选单元、第一目的蛋白表达单元、第二筛选单元和第二目的蛋白表达单元，其中，所述第一筛选单元的启动子的功能被弱化以使第一目的蛋白和第二目的蛋白的表达量升高，并且第二目的蛋白的表达量高于所述第一目的蛋白。2.如权利要求1所述的双基因表达载体，其中：(i)所述第一筛选单元包含启动子A、第一筛选基因和多聚腺苷酸(polyA)加尾信号1；(ii)所述第一目的蛋白表达单元包含启动子B、内含子、多克隆位点(MCS)1和polyA加尾信号2；(iii)所述第二筛选单元包含polyA加尾信号2、第二筛选基因、启动子C；并且(iv)所述第二目的蛋白表达单元包含启动子D、多克隆位点(MCS)2和polyA加尾信号3；其中，所述第二筛选单元相对于所述第一筛选单元、所述第一目的蛋白表达单元和所述第二目的蛋白表达单元反向插入，并且所述第一目的蛋白表达单元和所述第二筛选单元共用所述polyA加尾信号2。3.如权利要求2所述的双基因表达载体，其中任选地，所述第一筛选基因是编码宿主细胞缺陷酶的基因，所述第二筛选基因为抗生素抗性基因，并且所述编码宿主细胞缺陷酶的基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因或谷氨酰胺合成酶(GS)基因，所述第二筛选基因包括新霉素(neo)抗性基因、嘌呤霉素抗性基因或潮霉素抗性基因。4.如权利要求2～3任一项所述的双基因表达载体，其中所述启动子A是SV40早期启动子或衍生自SV40早期启动子，所述polyA加尾信号1是SV40早期polyA或衍生自SV40早期polyA；所述启动子B是CMV启动子或衍生自CMV启动子，所述内含子是CMV内含子或衍生自CMV内含子；所述启动子C是SV40启动子或衍生自SV40启动子，所述polyA加尾信号2是SV40晚期polyA或衍生自SV40晚期polyA；并且所述启动子D是hEF1-α启动子或衍生自hEF1-α启动子，所述polyA加尾信号3是BGHpolyA或衍生自BGHpolyA。5.一种构建如权利要求2～4任一项所述的双基因表达载体的方法，包括扩增程序和拼接程序，其中所述扩增程序包括步骤：(a)PC...

【专利技术属性】
技术研发人员：高荣凯，韩化敏，金瑾，
申请(专利权)人：拜西欧斯北京生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11